| dc.description.abstract | Der ATP-Binding-Cassette(ABC)-Transporter P-Glykoprotein (P-gp) spielt eine wichtige Rolle bei dem Phänomen der so genannten Multidrug-Resistenz (MDR). Bis heute ist es jedoch nicht gelungen, die breite Substratspezifität und den Funktionsmechanismus des Transporters vollständig zu klären. Im Rahmen dieser Arbeit sind die Interaktionsmöglichkeiten der Liganden des P-Glykoproteins sowie die räumliche Struktur des Transporters mithilfe von Molecular-Modelling-Methoden untersucht worden. Die Interaktion der Substrate und Modulatoren des P-gp mit dem Protein wurde dabei sowohl von der Seite der Liganden als auch des Proteins betrachtet.
Auf der Ligandenseite lag der Fokus auf der Hoechst 33342-Bindungsstelle, der neben dem Transport auch eine regulatorische Funktion zugeschrieben wird. Ausgehend von einer Konformationsanalyse von Hoechst 33342 konnte mithilfe weiterer Verbindungen ein Pharmakophormodell für diese Interaktionsstelle definiert werden.
Eine Gruppe von potenten Modulatoren der 3. Generation um Tariquidar (XR-Verbindungen), die mit der Hoechst 33342-Bindungsstelle interagieren, wurde näher untersucht. Unter Zuhilfenahme des Pharmakophormodells wurde ein Alignment festgelegt und QSAR- und 3D-QSAR-Untersuchungen durchgeführt. Diese identifizierten als wichtigstes strukturelles Merkmal für die starke inhibitorische Aktivität der Verbindungen die Präsenz eines an das Anthranilamid-Grundgerüst gebundenen aromatischen Substituenten mit einem Heteroatom in Position 3. Die mit der CoMFA- und CoMSIA-Methode erhaltenen 3D-QSAR-Modelle besaßen eine gute externe Vorhersagekraft (p2-Wert von 0,66-0,72) und stellten die durch das WBB-Akzeptor-Feld sowie sterisches und hydrophobes Feld beschriebenen dreidimensionalen Eigenschaften als die wichtigsten für die inhibitorische Aktivität heraus
Eine weitere 3D-QSAR wurde für eine Reihe neu entwickelter Modulatoren der 3. Generation, die WK-Verbindungen, durchgeführt. Die erhaltenen Modelle besitzen mit q2-Werten über 0,8 eine hohe interne Vorhersagekraft und beinhalten elektrostatische, sterische, WBB-Akzeptor- und hydrophobe Felder. Eine externe Validierung mit den XR-Verbindungen bestätigte die Vorhersagekraft mit Korrelationskoeffizienten von bis zu r2cv = 0,66 bzw. p2 = 0,75. Die Modelle können damit für die Vorhersage der Aktivitätswerte und die gezielte Entwicklung neuer P-gp-Modulatoren verwendet werden.
Mithilfe der zur Struktur von P-gp verfügbaren Information wurden dreidimensionale Modelle des Proteins erstellt und diese auf potenzielle Bindungstaschen untersucht. Das Homologiemodell basiert auf der Sav1866-Kristallstruktur und ist anhand experimenteller Daten aus Mutations-, Cross-linking- und Photoaffinitätsmarkierungs-Experimenten sowie den verfügbaren kryo-elektronenmikroskopischen Daten zu P-gp diskutiert worden. Im nächsten Schritt wurden mit den Programmen SiteID und Site Finder drei zumindest teilweise in der Membranebene lokalisierte Bindungsregionen identifiziert: eine an der Schnittstelle der Membran mit dem Zytosol und zwei in den transmembranären Domänen des Proteins. Die Bindungsregionen beinhalten kleinere Bindungstaschen, die in ihrer Größe, Orientierung und Aminosäurenbeteiligung variieren. Eine weitere Region, die Kavitätsregion, ist in der nach extrazellulär geöffneten zentralen Pore des Transporters lokalisiert. Die in den Bindungsregionen involvierten Aminosäuren zeigten eine sehr gute Übereinstimmung mit Aminosäuren, die in Experimenten eine Beeinflussung der P-gp-Funktion aufwiesen. Zusammenfassend zeigt die Analyse der Bindungsregionen, dass P-gp multiple Bindungsstellen besitzt und seine Substrate auf unterschiedliche Arten binden und transportieren kann. Die identifizierten Bindungsstellen und Taschen können als Basis für weitere Experimente sowie Molecular-Modelling-Studien dienen, mit dem Ziel, eine genauere Vorstellung von der Lage und dem Aussehen der Bindungsstellen des Proteins zu gewinnen.
Die Moleküldynamiksimulationen des Homologiemodells in der Membranumgebung zeigten ein stabiles Verhalten des Modells und bestätigten so seine Plausibilität. Die als Referenzuntersuchung durchgeführte Moleküldynamiksimulation für die Sav1866-Kristallstruktur unterstützt ebenfalls diese Ergebnisse und zeigte für Sav1866 ein mit dem Homologiemodell vergleichbares Verhalten.
Einen Hinweis für die Eignung der Moleküldynamik als Methode zur Beurteilung der Plausibilität einer dreidimensionalen Struktur lieferte die Moleküldynamik der alten MsbA-Kristallstruktur aus S. typhimurium. So durchlief diese, heute als fehlerhaft bekannte, Kristallstruktur während der Simulation eine Kippbewegung der beiden homologen Transporterhälften und zeigte allgemein viel größere Veränderungen als sie für Sav1866 oder das Homologiemodell zu beobachten waren. Damit wird deutlich, dass ein instabiles Verhalten in der Moleküldynamiksimulation Unstimmigkeiten in den dreidimensionalen Strukturen aufzeigen kann. | |
