Zur Kurzanzeige

Expression und Untersuchung von Enzymen der Pederin-Biosynthese aus einem nicht kultivierten Symbionten

dc.contributor.advisorPiel, Jörn
dc.contributor.authorZimmermann, Katrin
dc.date.accessioned2020-04-12T18:24:47Z
dc.date.available2020-04-12T18:24:47Z
dc.date.issued2008
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/20.500.11811/3688
dc.description.abstractDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Enzymen des ped-Genclusters aus einem bisher nicht kultivierten Symbionten.
Der ped-Cluster gehört zu Typ-I-Polyketidsynthasen (PKS), in denen die Acyltrans-ferasen (AT) in trans agieren. Die PKS ist modular aufgebaut, wobei jedes Modul in Domänen untergliedert ist. Zwei Module bestehen aus Nichtribosomalen Peptid-synthetasen (NRPS). Dem Cluster wird die Herstellung von Pederin zugeschrieben, eine sehr wirksame Antitumorsubstanz, die in Käfern der Gattung Paederus und Paederidus gefunden werden kann. Die eigentliche Biosynthese von Pederin wird wahrscheinlich durch einen in den Käfern lebenden bakteriellen Symbionten durchgeführt, der ein naher Verwandter von Pseudomonas aeruginosa ist.
Für genauere Hinweise auf die Funktionen einzelner Enzyme während der Pederin-Biosynthese wurden verschiedene Gene des putativen Genclusters kloniert und exprimiert. Die aufgereinigten Proteine konnten anschließend in Enzym-Assays eingesetzt werden. Hauptaspekt der Arbeit waren dabei zum einen die AT und Acylcarrierproteine (ACP) und zum anderen die O-Methyltransferasen (O-MT). Dabei sollten Substrat- und ACP-Spezifität der AT und die Regioselektivität der O-MT näher beleuchtet werden.
Von den untersuchten ACP wurde PedN, codiert als separates Gen, und PedI3, eine Doppel-ACP innerhalb eines Moduls, erfolgreich als His8-Fusionsprotein exprimiert. Die Umsetzung vom apo- zum aktiven holo-ACP gelang durch die Verwendung von Svp, eine Phosphopantetheinyltransferase aus Streptomyces verticillus ATCC15003. Die Bestätigung der erfolgten Phosphopantetheinylierung erfolgte durch MALDI-TOF- bzw. ESI-FT-ICR-MS. Die beiden vorhandenen AT PedC und PedD konnten als MBP- bzw. His8-Fusionsprotein hergestellt werden. Eine Expression von PedC mit N-terminalen His8 brachte nur unlösliches Protein hervor. Zur Untersuchung der ACP-AT-Assays konnte die Verwendung von radioaktiv markierten Substraten als geeignete Methode herausgestellt werden. Dabei zeigte sich, dass PedD in der Lage ist, Malonyl-CoA zu übertragen, während es Acetyl-CoA nicht als Substrat nutzen kann. Der Transfer von Malonyl-CoA erfolgt dabei sowohl auf PedN als auch auf PedI3. Die AT weist demnach eine Substrat- jedoch keine ACP-Spezifität auf. PedC zeigte weder gegenüber Malonyl- noch Acetyl-CoA Aktivität und ist nach bisherigen Daten nicht in der Lage, das Substrat auf die ACP zu übertragen. Am Ende wurde auch die GCN5-verwandte N-Acetyltransferase (GNAT) mit dem darauffolgenden ACP kloniert und als His8-Fusionsprotein exprimiert. Bei der GNAT könnte es sich um den Überträger des Startersubstrates Acetyl-CoA handeln. Kinetische Untersuchungen des Transfers von Malonyl-CoA auf PedN durch PedD wurden begonnen. Die Durchführung dieser Untersuchung muss jedoch noch optimiert werden, um die entsprechenden Parameter kcat und Km zu ermitteln.
Da Pederin vier Methoxygruppen, der ped-Cluster aber nur die drei O-MT PedA, PedE und PedO enthält, sollten diese untersucht werden. Sie wurden jeweils als MBP- und His8-Fusionsprotein erfolgreich exprimiert. Als Substratanaloga dienten Mycalamid A und B aus dem Schwamm Mycale hentscheli, die weniger O-Methylierungen als Pederin aufweisen, ihm strukturell aber sehr ähneln. Die Enzym-Assays von Fusionsprotein, Substrat und S-Adenosylmethionin (SAM) als Kofaktor wurden mittels ESI-micrOQ-TOF-MS analysiert. Dabei zeigte sich, dass PedO in der Lage ist, eine Hydroxylgruppe in Mycalamid A zu methylieren. MS/MS-Versuche stellten heraus, dass es sich um die Methylierung der OH-Gruppe an C17 oder C18 handeln muss. Die Derivatisierung des Reaktionsproduktes sowie LC-MS brachten keine spezifischeren Aussagen. Die Analyse des Reaktionsproduktes aus PedO und Mycalamid A mittels 1D- und 2D-NMR lieferte aber das Ergebnis, dass es sich um 18-O-Methylmycalamid A handeln muss. Diese durch PedO erzeugte Substanz ist nicht als Naturstoff bekannt und stellt ein neues Mitglied der Mycalamide dar. Damit wurde der erste funktionelle Beweis erbracht, dass der ped-Gencluster für die Biosynthese von Pederin verantwortlich ist.
OnnD, eine O-MT aus dem onn-Gencluster (putativer Cluster der Biosynthese von Onnamid A aus Theonella swinhoei) wurde erfolgreich als MBP-Fusionsprotein exprimiert. Der entsprechende Enzym-Assay mit Pederin als Substrat zeigte keine O-Methylierung. Demnach scheint OnnD nicht für die Methoxygruppe an C13 zuständig zu sein, oder Pederin wird als Strukturanaloga nicht akzeptiert.
Für zukünftige Versuche wurden die Oxidoreduktase PedB, die beiden A-Domänen, die Ketosynthase PedM und die HMGCoA-Synthase PedP als MBP- und teilweise als His8-Fusionsprotein erfolgreich exprimiert. Die beiden letztgenannten Enzyme sind wahrscheinlich an der Bildung der Exomethylengruppe an C4 in Pederin beteiligt. Die A-Domänen sind Bestandteile der NRPS und für die Auswahl und Aktivierung der jeweils einzubauenden Aminosäure erforderlich.
dc.description.abstractExpression and analysis of enzymes of the pederin biosynthetic pathway from an uncultivated symbiont
Presented here are the results of work carried out on the ped-cluster enzymes from an uncultivated symbiont.
The ped-cluster encodes a type I polyketide synthase (PKS), in which the acyltransferases (AT) act in trans. The PKS consists of modules that are divided into domains. Two of these modules harbor non-ribosomal peptide synthetases (NRPS). Strong evidence exists that the cluster encodes the biosynthesis of pederin, a highly active antitumor compound. Pederin can be found in beetles of the genera Paederus and Paederidus, but biosynthesis of pederin is performed by a bacterial symbiont that lives in the beetle and that has a close relationship to Pseudomonas aeruginosa.
In order to gain further insights into the function of distinct enzymes during the biosynthesis of pederin, different genes of the putative gene cluster were cloned and expressed. The purified enzymes were then used for enzyme assays. An important aspect of the work was to look at the AT and acyl carrier proteins (ACP) as well as the O-methyltransferases (O-MT). Investigations into substrate- and ACP-specifity of the AT and regioselectivity of the O-MT was carried out.
Successful expression as His8-fusion protein in the case of the tested ACP was carried out for PedN, encoded as a separate gene, and PedI3, a didomain-ACP within a module of the PKS. Use of Svp, a phosphopantetheinyltransferase from Streptomyces verticillus ATCC15003, leads to conversion of apo-ACP, forming an active holo-ACP. Confirmation of the successful phosphopantetheinylation was ascertained using MALDI-TOF- and ESI-FT-ICR-MS. The two available AT PedC und PedD were produced as maltose binding- or His8-fusion proteins. Expression of PedC with N-terminal histidine tag resulted only in insoluble protein. For analysis of the ACP-AT-assays the use of radioactive labeled substrates was found to be the favourable method. This method showed that PedD is able to use malonyl-CoA as a substrate, but not acetyl-CoA. PedD transfers malonyl-CoA to PedN as well as to PedI3. The AT PedD showed substrate, but not ACP-specifity. PedC had no affinity for malonyl- or acetyl-CoA. Preliminary data suggest that PedC is not able to transfer any substrate to the ACP. The GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) with the neighbouring ACP was also cloned and expressed as His8-fusion protein. GNAT is probably responsible for the transfer of the initiation substrate, acetyl-CoA.
Kinetic experiments for the transfer of malonyl-CoA to PedN by PedD have been started, but the procedure must still be optimized in order to obtain the appropriate parameters kcat and Km.
Because pederin has four methoxygroups, but the ped-cluster only contains three O-MT, these three enzymes (PedA, PedE and PedO) were examined. Each of them was successfully expressed as maltose binding- and as His8-fusion proteins. Mycalamide A and B from the sponge Mycale hentscheli were used as substrate analogues. They have less O-methylations, but their structure is very close to that of pederin. The enzyme-assays of the fusion proteins were carried out with substrate and the cofactor S-adenosylmethionine (SAM). These were analysed by ESI-micrOQ-TOF-MS. This showed that PedO is able to methylate one hydroxyl group of mycalamide A. MS/MS-experiments revealed that the methylation occurs at the C17 or C18 OH-group. Derivatisation of the reaction product or LC-MS did not provide more specific conclusions. Analysis of the product of PedO and mycalamide A using 1D- and 2D-NMR showed that 18-O-methylmycalamide A was formed. This substance is not a known natural product and is a new member of the mycalamides. These results represent the first functional proof that ped-gene cluster encodes for the biosynthesis of pederin.
The O-MT OnnD from the onn-cluster (putative gene cluster for biosynthesis of onnamide A from Theonella swinhoei) was successfully expressed as maltose binding fusion protein. The enzyme assay with pederin as the substrate showed no O-methylation. It seems that OnnD is either not responsible for the methylation of OH at C13, or it does not accept pederin as structural analogue.
For future experiments, the oxidoreductase PedB, the two A-domains, the ketosynthase PedM and the HMGCoA-synthase PedP have been successfully expressed as maltose binding- and partly as His8-fusion proteins. The latter two enzymes are likely involved in the formation of the exomethylene group at C4 of pederin. The A-domains, which are part of the NRPS, are responsible for the choice and activation of the amino acids that are built in.
dc.language.isodeu
dc.rightsIn Copyright
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subjectPederin
dc.subjectPolyketid
dc.subjecttrans-AT
dc.subjectEnzymexpression
dc.subjectPaederus
dc.subjectPKS
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleExpression und Untersuchung von Enzymen der Pederin-Biosynthese aus einem nicht kultivierten Symbionten
dc.typeDissertation oder Habilitation
dc.publisher.nameUniversitäts- und Landesbibliothek Bonn
dc.publisher.locationBonn
dc.rights.accessRightsopenAccess
dc.identifier.urnhttps://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-15457
ulbbn.pubtypeErstveröffentlichung
ulbbnediss.affiliation.nameRheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
ulbbnediss.affiliation.locationBonn
ulbbnediss.thesis.levelDissertation
ulbbnediss.dissID1545
ulbbnediss.date.accepted17.09.2008
ulbbnediss.fakultaetMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
dc.contributor.coRefereeSahl, Hans-Georg


Dateien zu dieser Ressource

Thumbnail

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige

Die folgenden Nutzungsbestimmungen sind mit dieser Ressource verbunden:

InCopyright