Analytik von ozoninduzierten phenolischen Sekundärmetaboliten in <i>Nicotiana tabacum</i> L. cv Bel W3 mittels LC-MS

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche löslichen, phenolischen Sekundärmetabolite unter einem akuten Ozonstress verstärkt oder neu in der ozonsensitiven Tabakvarietät <i>Nicotiana tabacum</i> L. cv Bel W3 gebildet werden. Allgemein wurde für phenolische Substanzen bisher sowohl eine Rolle in der durch einen akuten Ozonstress hervorgerufenen antioxidativen Abwehr als auch in der ozoninduzierten Pathogenabwehr diskutiert. Durch die in dieser Arbeit durchgeführte detaillierte Analyse der induzierten Metabolite, sollte eine klarere Definition der möglichen Funktion von löslichen, induzierten phenolischen Sekundärmetaboliten in der Antwort auf einen Ozonstress erzielt werden.<br /> Für die Ermittlung der ozoninduzierten Metabolite wurden zunächst eine Probenvorbereitung und eine LC-ESI-MS-Methode mit der Ionenfalle im Full Scan für typische Vertreter der phenolischen Substanzen entwickelt. Nach Messungen mit der LC-ESI-MS-Methode wurden, mit Unterstützung des Algorithmus CODA der Software ACD/MS Manager (ACD/Labs, Toronto, Canada), durch vergleichende Analyse der Chromatogramme von ozonbehandelten Proben und den entsprechenden Kontrollproben 25 ozoninduzierte Substanzen ermittelt. <br /> Mit Fragmentierungsreaktionen in der Ionenfalle wurden anschließend 14 ozoninduzierte phenolische Substanzen anhand ihrer Fragmentspektren strukturell aufgeklärt. Eine Absicherung der Strukturaufklärung erfolgte unter anderem durch die Ermittlung der Summenformeln der jeweiligen Sekundärmetabolite anhand der durch FTICR-MS-Messungen ermittelten akkuraten Massen.<br /> Bei zwei der strukturell aufgeklärten Substanzen handelt es sich um Salicylsäure (SA) und Salicylsäure-ß-D-glucopyranosid (SA-G), deren Induktion unter einem akuten Ozonstress damit bestätigt wurde. Die weiteren strukturell aufgeklärten Metabolite wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals unter einem akuten Ozonstress als induziert beschrieben. Bei diesen Substanzen handelt es sich um <i>E-/Z</i>-5-Feruloylchinasäure (FQA), <i>E-/Z</i>-4-p-Coumaroylchinasäure (CoQA), <i>E-/Z</i>-5-p-CoQA, <i>E-/Z</i>-3-p-Comaroylshikimisäure (CoShiA) sowie vier Isomere des Feruloyltyramins (FT).<br /> Für die Durchführung einer relativen Quantifizierung der ozoninduzierten Metabolite wurde eine Multiple Reaction Monitoring- (MRM-) Methode mit einem Triple Quadrupol entwickelt. Mit dieser MRM-Methode wurden zunächst die zeitlichen Verläufe der ozoninduzierten Metabolite 10 h sowie 30 h nach Beginn der Ozonexposition ermittelt. Dabei wurde als einzige Substanz mit einem transienten Verhalten die SA bestimmt, so dass vermutlich keine weiteren phenolischen Substanzen unter einem akuten Ozonstress eine Rolle als Signalsubstanz spielen. Alle anderen ozoninduzierten Metabolite zeigten eine Akkumulation im zeitlichen Verlauf, weswegen diese Substanzen wahrscheinlicher eine Rolle in der Pflanzenabwehr spielen könnten.<br /> Um Hinweise zu erhalten, welcher Pflanzenabwehr die ozoninduzierten Metabolite vermutlich zugeordnet werden können, wurden Blätter von <i>N. tabacum</i> L. cv Bel W3 mit einer anderen Art eines oxidativen Stresses durch eine Behandlung mit Paraquat© (PQ) in Konzentrationen von 10 und 100 µM l^-1 behandelt. Des Weiteren wurde in Blättern von <i>N. tabacum</i> L. cv Bel W3 ein Pathogenstress durch eine Infektion mit dem avirulenten Bakterium <i>Pseudomonas syringae</i> pv <i>syringae</i> (<i>Pss</i>) hervorgerufen. Durch eine relative Quantifizierung der ozoninduzierten Metabolite der mit PQ und <i>Pss</i> behandelten Blätter sowie der entsprechenden Kontrollen mit der entwickelten MRM-Methode wurde gezeigt, dass alle 25 ozoninduzierten Metabolite auch unter dem Pathogenstress mit <i>Pss</i> induziert werden. Unter einem oxidativen Stress, wie er unter der Behandlung mit PQ in einer Konzentration von 10 µM l^-1 auftritt, wurde dagegen nur einer der ozoninduzierten Metabolite induziert, so dass alle anderen ozoninduzierten Metabolite vermutlich überwiegend der Pathogenabwehr zugeordnet werden können. So könnten z. B. die strukturell aufgeklärten FT-Isomere durch eine Vernetzung mit Lignin zu einer Verstärkung der Zellwand beitragen. Des Weiteren könnten sie zugleich auch antimikrobiell wirksam sein. Die p-CoShiA- und p-CoQA-Isomere sind wichtige Zwischenprodukte der Phenylpropanoidbiosynthese und spielen auch eine wichtige Rolle in der Synthese der Ligninmonomerbausteine. Diese löslichen, phenolischen Sekundärmetabolite könnten somit in der ozoninduzierten Pathogenabwehr zu einer Verstärkung der Zellwände führen. Insgesamt weisen die Ergebnisse auf eine Umprogrammierung im Ligninstoffwechsel, sowohl in Folge der Reaktion auf einen akuten Ozonstress als auch in Folge der Reaktion auf einen Pathogenbefall, hin.