Einfluss von Rezeptorglykosylierung und Lipidmembranumgebung auf die Ligandbindung muskarinischer Acetylcholinrezeptoren unter besonderer Berücksichtigung der allosterischen Bindungsstelle

Abstract

Bisher ist unklar, ob die Ligandbindung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren von der Rezeptor-N Glykosylierung oder der Lipidmembranumgebung des Rezeptorproteins abhängt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mittels molekularer Sonden zu prüfen, inwiefern die genannten Modifikationen Einfluss auf den Eingang der Ligandbindungstasche der extrazellulären Schleifenregion des muskarinischen M₂ Rezeptorproteins nehmen. Als Molekülsonden wurden typische und atypische allosterische Modulatoren eingesetzt. Zu den typischen allosterischen Modulatoren zählt die Alkanbisammonium-Verbindung W84 (N,N’-Bis[3-(1,3dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)propyl]-N,N,N’,N’-tetramethyl-1,6-hexan-diammoniumdibromid) und die Bispyridinium-Verbindung WDuo3 (1,3 bis[4(phthalimidomethoxyimino-methyl)-pyridinium-1yl]-propan-dibromid). Atypische allosterische Liganden, wie die WDuo3-verwandte Verbindung Duo3 (4,4’-bis[(2,6-dichloro-benzyloxy-imino)-methyl]-1,1’–propan-1,3–diyl–bis–pyridinium-dibromid), weisen Besonderheiten ihrer Wirkung auf, wie beispielsweise steile Konzentrations-Effekt-Kurven und eine geringere Pufferabhängigkeit der allosterischen Wirkung. Es wird angenommen, dass der atypische allosterische Modulator Duo3 weiter im Bereich der extrazellulären Schleifen des M2-Rezeptorproteins bindet und die Kernregion des allosterischen Haftareals im Gegensatz zum typischen Modulator WDuo3 nicht erreicht. <br /> Erste Untersuchungen zeigten, dass sich die Interaktion typischer und atypischer Modulatoren mit humanen M₂-Rezeptoren nicht nennenswert zwischen CHO und COS7-Zellen, die als Expressionssysteme dienten, unterschied. <br /> Um den Einfluss eines ausgeprägten N-Glykosylierungsdefekts zu untersuchen, wurden M₂-Rezeptoren, die in Lec1-Zellen exprimiert wurden, verwendet. Diese Zellen sind nicht mit dem Enzym N-Acetylglucosaminglykosyltransferase I ausgestattet und Glykosylierungsschritte können nur bis zu N-Glykanen vom „High-Mannose-Typ“ vollzogen werden, so dass nachfolgende Modifikationen wie der Einbau endständiger Sialinsäuremoleküle ausbleiben. An M₂-Rezeptorpräparationen aus diesen Zellen zeigte sich in Radioligand-Bindungsstudien ein signifikanter Verlust der Bindungsaffinität des atypischen Modulators Duo3, während die Bindungseigenschaften des typischen Modulators WDuo3 weitgehend unbeeinflusst blieben. Überdies konnte keine Beeinträchtigung der orthosterischen Ligandbindung festgestellt werden.<br /> Mit veränderten Lipidmembran-Zusammensetzungen wurden Modifikationen in der Umgebung des M2 Rezeptorproteins betrachtet. Zu diesem Zweck wurden Radioligand-Bindungsuntersuchungen mit humanen, muskarinischen M₂-Rezeptoren, die in CHOGalT- und CHOSULF-Zellen exprimiert wurden, durchgeführt. CHOGalT-Zellen sind stabil mit dem Gen des Enzyms Galactosyltransferase transfiziert und die Zellmembran ist durch einen hohen Anteil des Cerebrosids Galactosylceramid gekennzeichnet. In CHOSULF-Zellen liegt zudem neben Galactosyltransferase das Enzym Sulfotransferase vor, so dass es in der Lipidmembranumgebung zu einer Anhäufung des Cerebrosidsulfats Sulfatid kommt. In einem Puffersystem mit niedriger Ionenstärke ergab sich an Rezeptoren in einer mit Sulfatid angereicherten Membran eine stärkere Beeinflussung der Affinität des typischen allosterischen Modulators WDuo3 als der Affinität der atypischen Testsubstanz Duo3. Eine sulfatierte Membranumgebung betrifft daher offenbar besonders die Kernregion des allosterischen Bindungsareals. Ein Puffermilieu erhöhter Ionenstärke vermochte den Einfluss der Lipidumgebung auf das Bindungsverhalten allosterischer Liganden aufzuheben. Eine mit Galactosylceramid oder Sulfatid angereicherte Rezeptormembranumgebung nahm allerdings keinen Einfluss auf die Bindung orthosterischer Liganden.<br /> Um die postulierte andersartige Orientierung des Duo3-Moleküls innerhalb des allosterischen Haftareals zu überprüfen, wurde die Abhängigkeit der Bindung der atypischen Testsubstanz Duo3 und des typischen Modulators WDuo3 von der innerhalb der fünf Muskarinrezeptorsubtypen konservierten Aminosäure M₂⁴²²Tryptophan untersucht. Dieses Epitop liegt in der allosterischen Kernregion am Übergang zur orthosterischen Bindungsstelle des physiologischen Transmitters Acetylcholin. Die Affinität von WDuo3 nahm an der Rezeptormutante M₂⁴²²Trp->Ala signifikant um 1,2 Dekaden ab. In Analogie zu einem 3-dimensionalen Rezeptormodell ließ dies auf eine direkte Interaktion mit der Aminosäure schließen. Duo3 hingegen zeigte nur eine schwache Abhängigkeit seiner Bindungsaffinität von M₂⁴²²Tryptophan auf, was für einen indirekten Einfluss der Mutation aufgrund von Konformationsänderungen des Rezeptorproteins spricht. Durch den Austausch der benachbart liegenden Aminosäure M_2⁹⁹Tryptophan gegen Alanin zeigte sich eine ausgeprägte Epitopabhängigkeit des typischen Modulators WDuo3, die Affinität von Duo3 wurde hingegen nicht vermindert. <br /> In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass sowohl die N Glykosylierung als auch die Lipidumgebung des M₂-Rezeptorproteins einen Einfluss auf die allosterische Ligandbindung nehmen können, wohingegen die orthosterische Ligandbindung von beiden biochemischen Modifikationen nicht beeinflusst wird.