Untersuchungen zur Suberinentwicklung und der Bedeutung von Cytochrom P-450 Monooxygenasen bei der Suberinbiosynthese in <i>Arabidopsis thaliana</i>

Abstract

<p>Der lipophile Biopolyester Suberin bildet wichtige Barrieren um die Pflanze vor der Umgebung zu schützen oder verschiedene Gewebe innerhalb der Pflanze zu trennen. In der Wurzel wird Suberin in die Zellwände der Endodermis und Hypodermis und in das Periderm eingelagert. Aus Suberin bestehende apoplastische Barrieren erfüllen die Herausforderung den Wasser- und Nährstoffverlust zu begrenzen und das Eindringen von Pathogenen zu verhindern. Trotz der großen physiologischen Bedeutung des Suberins und der Kenntnis der Suberinzusammensetzung von vielen Pflanzenspecies, ist wenig über die Biosynthese und die dabei beteiligten Gene bekannt. In dieser Arbeit wird eine detailierte Analyse der aliphatischen Suberinzusammensetzung der Arabidopsis-Wurzel in verschiedenen Alters- und Entwicklungsstadien gezeigt. Diese Untersuchung zeigt große Veränderungen der Suberinzusammensetzung und -menge während der Wurzelentwicklung von Arabidopsis und verdeutlicht den großen Stellenwert der ω-Hydroxylierung für die Suberinbiosynthese. Eine Studie der Suberinisierung der Arabidopsis-Wurzel bei NaCl-Behandlung demonstriert die große physiologische Bedeutung der Suberineinlagerung für das Pflanzenwachstum unter ungünstigen Umweltbedingungen. Anhand von Datenbankrecherchen und Expressionsstudien wurden CYP81F4, CYP86A1, CYP705A1 und CYP705A13 als Kandidatengene für eine Beteiligung an der Suberinbiosynthese ausgewählt. Über einen revers genetischen Ansatz konnte CYP86A1 als Cytochrom P450 Fettsäure ω-Hydroxylase und als Schlüsselenzym für die Biosynthese von aliphatischem Wurzelsuberin in Arabidopsis identifiziert werden. Die korrespondierenden cyp86a1 Mutanten zeigten eine beträchtliche Reduktion an ω-Hydroxysäure mit einer Kettenlänge <C20, was die Funktion von CYP86A1 als Hydroxylase der suberinisierten Wurzelgewebe demonstriert. Detailierte Expressionsstudien offenbarten eine starke Wurzelspezifität und eine endodermisspezifische Expression. Die transgene Expression eines CYP86A1:GFP Fusionsproteins zeigte eine Lokalisation am Endoplasmatischen Retikulum. Dies deutet darauf hin, dass die Biosynthese von Suberinmonomeren am Endoplasmatischen Retikulum stattfindet.</p>

<p><b>Investigation of the suberin development and the meaning of cytochrome P-450 monooxygenases for the suberin biosynthesis in <i>Arabidopsis thaliana</i></b><br /> The lipophilic biopolyester suberin forms important boundaries to protect the plant from its surrounding environment or to separate different tissues within the plant. In roots, suberin can be found in the cell walls of the endodermis and the hypodermis or periderm. Apoplastic barriers composed of suberin accomplish the challenge to restrict water and nutrient loss and prevent the invasion of pathogens. Despite the physiological importance of suberin and the knowledge of the suberin composition of many plants, very little is known about its biosynthesis and the genes involved. Here, a detailed analysis of the Arabidopsis aliphatic suberin in roots at different ages and developmental stages is presented. This study demonstrates some variability in suberin amount and composition during root development and indicates the importance of ω-hydroxylation for suberin biosynthesis. An analysis of NaCl treated Arabidopsis roots revealed an increased suberin amount and points out the physiological importance of suberin deposition for plant growth under unfavorable environmental conditions. By the investigation of databases and performed expressionstudies CYP81F4, CYP86A1, CYP705A1 and CYP705A13 have been chosen as candidate genes for an involvement in suberin biosynthesis. Using reverse genetics, only CYP86A1 could be identified as cytochrome P450 fatty acid ω-hydroxylase and as a key enzyme for aliphatic root suberin biosynthesis in Arabidopsis. The corresponding cyp86a1 mutants show a substantial reduction in ω-hydroxyacids with a chain length <C20, demonstrating that CYP86A1 functions as a hydroxylase of root suberized tissue. Detailed expression studies revealed a strong root specificity and a localized expression in the root endodermis. Transgenic expression of CYP86A1 fused to GFP distributed CYP86A1 to the endoplasmic reticulum, indicating that suberin monomer biosynthesis takes place in this sub-cellular compartment before intermediates are exported in the apoplast. </p>