Charakterisierung der lateralen Diffusion einzelner β₂-adrenerger Rezeptor-Ligand-Komplexe an lebenden Zellen

Abstract

<p>Die vorliegende Arbeit beschreibt das laterale Diffusionsverhalten von Komplexen aus ß₂-adrenergem Rezeptor (ß₂AR) und dem Liganden Noradrenalin, gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor 532 (Alexa-NA), auf der Plasmamembran von A549-Zellen. Nach Etablierung eines Einzelmolekülmikroskops konnte durch die Detektion und Verfolgung einzelner Rezeptor-Ligand-Komplexe das Bewegungsverhalten detailliert analysiert werden. Anhand der Bewegungspfade konnten unterschiedliche Diffusionstypen charakterisiert und verschiedene Rezeptorzustände differenziert werden. Neben immobilen wurden insbesondere ß₂AR-Alexa-NA-Komplexe mit einer langsamen lateralen Mobilität gefunden, die sich bevorzugt in räumlich begrenzten Domänen bewegten. Aus der Länge der Einzeltrajektorien konnte außerdem Rückschlüsse auf eine kurze Existenzdauer der Rezeptor-Ligand-Komplexe gezogen werden. Eine agonistische Stimulation mit Terbutalin beeinflusste das Diffusionsverhalten der verschiedenen Rezeptorzustände. Die Mobilitätsverteilung, die ermittelten Diffusionskoeffizienten sowie die laterale Ausdehnung der Einzelmolekülpfade veränderten sich durch die einsetzenden Desensitivierungs- und Internalisierungsprozesse, die durch die Stimulation ausgelöst wurden. Durch Unterbrechung der Signaltransduktion mittels Choleratoxin konnte gleichfalls Einfluss auf die laterale Diffusion der ß₂AR-Alexa-NA-Komplexe genommen werden.<br /> Unter gleichen experimentellen Bedingungen wurden fluoreszenzkorrelationsspektroskopische Messungen durchgeführt. Diese offenbarten insbesondere eine sehr kurze Bindungsdauer des Liganden Alexa-NA an den ß₂AR sowie die Existenz unspezifischer kurzer Kollisionsereignisse des Liganden mit der Plasmamembran. Die agonistische Terbutalinstimulation führte zu einer ausgeprägten Verdrängung von Alexa-NA vom ß₂AR.<br /> Unter den gegebenen experimentellen Bedingungen konnten sowohl die Stärken der verwendeten Techniken als auch ihre Grenzen deutlich herausgearbeitet werden. Durch ergänzende Verwendung von Einzelmolekülmikroskopie und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie gelingt eine detaillierte Beschreibung von Diffusions- sowie Bindungsereignissen membranärer Rezeptoren. </p>

<p><strong>Characterization of the lateral diffusion of single ß₂-adreneric receptor-ligand-complexes in living cells : Potential and limitations of single molecule microscopy and fluorescence correlation spectroscopy</strong><br /> The present work describes lateral diffusion of the ß₂-adrenergic receptor (ß₂AR) complexed with noradrenaline labelled using the fluorescent dye Alexa Fluor 532 (Alexa-NA) in membranes from A549-cells. In order to study lateral diffusion, trajectories for single receptor-ligand-complexes were investigated using single molecule microscopy. Different diffusion modes, corresponding to different receptor states, were observed. In addition to immobile ß₂AR-Alexa-NA-complexes, particularly slow lateral mobilities were observed for receptors in constricted domains. Short trajectory lengths indicated short dwell times for receptor-ligand-complexes. Agonistic stimulation with terbutaline influenced the diffusion behaviour of the different receptor states. As a result the distribution of mobilities, the diffusion coefficients, and the size of the trajectories were altered. After blocking signal transduction with choleratoxin, lateral receptor-ligand-complex mobility was affected. <br /> Fluorescence correlation spectroscopy measurements were performed under similar experimental conditions. In particular, a rather short ligand binding lifetime on the ß₂AR and the existence of unspecific transient collision events between Alexa-NA and the plasma membrane were seen. Terbutaline treatment of the cells decreased Alexa-NA binding to the ß₂AR.<br /> The potential and limitations of both, single molecule microscopy and fluorescence correlation spectroscopy, are discussed. In practice, each technique provides detailed information describing the diffusion and binding properties of membrane receptors. </p>