Die Bedeutung von CpG-Oligonukleotiden für den myokardialen Reperfusionsschaden

Abstract

Die angeborene Immunabwehr spielt mit ihren Toll-like Rezeptoren eine wichtige Rolle in der myokardialen Ischämie und Reperfusion (I/R). TLR9 ist der primäre Rezeptor für bakterielle DNA. Sie zeichnet sich durch spezielle Sequenzen aus, sog. CpG-Motive, die zu 98% unmethyliert vorliegen. Verschiedenste Studien konnten zeigen, dass eine repetitive Schädigung (Präkonditionierung) vor myokardialer Ischämie kardioprotektive Wirkungen besitzt. In der vorgestellten Studie sollte die Bedeutung von CpG-Oligonukleotiden im Ischämie-Reperfusionsversuch eruiert und zudem die diagnostische Relevanz des kardialen Troponin T (cTNT) untersucht werden. Darüber hinaus sollten die funktionellen und hämodynamischen Aspekte einer CpG-Vorbehandlung sowie molekulare Mechanismen eingehend untersucht werden.<br /> Während der Initaloperation (Instrumentierung) wurde die linke anteriore deszendierende Koronararterie (LAD) bei C57BL/6 Mäusen mit einem Okkluder versehen, um nach abgeschlossener Wundheilung („closed-chest“-Modell) eine 60-minütige Ischämie hervorrufen zu können. 16 Stunden vor Infarkt erfolgte die jeweilige Vorbehandlung mit einem der drei synthetischen Äquivalente der bakteriellen DNA, sog. CpG-ODNs, oder PBS (Kontrolle). Anhand der Reperfusionszeiten können drei Teilstudien unterschieden werden. Nach 3 h Reperfusion wurden die Expressionen proinflammatorischer Zytokine im Herzen bestimmt. Nach 24 h Reperfusion die Herzen histologisch untersucht, kardiale Plasmatroponin T-Werte ermittelt und erste funktionelle und hämodynamische Parameter evaluiert. Einer 2-wöchigen Reperfusionsphase schloss sich erneut die histologische Herzfärbung und planimetrische Vermessung der Infarktgrößen an sowie die Darstellung der myokardialen Funktion und Hämodynamtik mit Hilfe der Echokardigraphie und Herzkatheterisierung.<br /> Mäuse, welche eine 5 nmolare 1668-ODN-Vorbehandlung erhielten, hatten kleinere Infarkte und geringere cTNT-Konzentrationen nach I/R als die Kontrolltiere mit einer äquivalenten PBS-Gabe. Andere 1668-Stimulationskonzentrationen (1, 10 und 20 nmol) hatten keinen nachweisbaren präkonditionierenden Effekt, vielmehr führte die erhöhte ODN-Gabe zum Anstieg der Mortalitätsraten auf bis zu 80%. Tiere mit einer 1612- bzw. H154- Vorbehandlung zeigten dagegen keine signifikant reduzierten Infarktgrößen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Damit ist die Aktivierung von TLR9 durch CpD-ODNs maßgeblich für das Ausmaß der myokardialen Schädigung mitverantwortlich. Außerdem war nach einer 1668-ODN-Stimulation tendenziell eine Reduktion der inflammatorischen Antwort auf I/R in Form eines verringerten Zytokinanstiegs nachweisbar. Zusätzlich führte sie zu tendenziell verbesserten diastolischen Blutdruckwerten sowie Ejektionsfraktionen. Hier bedarf es jedoch weiterer Untersuchungen.<br /> Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren erstmals, dass CpG-Oligonukleotide Mediatoren des Ischämie-Reperfusionsschadens sind. Eine TLR9-vermittelte CpGPräkonditionierung führte konzentrations- und sequenzabhängig zur Reduktion des Myokardinfarktes sowie zur Verringerung der kardialen Troponin T-Plasmakonzentration. Demnach besitzt CpG-ODNs ein therapeutisches Potential nicht nur bei malignen Krankheiten und Infektionserkrankungen, sondern auch bei der Behandlung von Myokardinfarkt und sepsisähnlichen Erkrankungen.

<strong>The importance of CpG oligonucleotides for the myocardial reperfusion injury</strong><br /> Toll-like receptors are important regulators of the innate immunity, e.g. TLR9 is responsible for the detection of bacterial DNA. Bacterial DNA is characterized by special sequences, so called CpG-motives, of which 98% are unmethylated. Interestingly, TLRs also play a role in myocardial ischemia and reperfusion (I/R) injury. Several studies have shown pretreatment (preconditioning) of animals with lipopolysaccharide (LPS), a TLR4 ligand, reduces a cardiac injury caused by I/R up to 16 h after LPS challenge. This study examined whether TLR9 stimulation may also function as preconditioning signal cardiac I/R injury. Therefore CpG oligonucleotides were applied as stimuli pior to ischemia/reperfusion injury of the murine heart.<br /> Ischemia was induced in a “closed chest model”. In an initial operation an occluder was implanted around left anterior descending coronary artery (LAD) of the heart of C57BL/6 mice. After wound healing mice underwent 60 minutes of ischemia by pulling at the occluder without opening the thorax of the mouse. 16 hours before infarction they were pre-treated with one of three different synthetic equivalents of bacterial DNA, referred to as CpG-ODNs, or PBS (control). On the basis of reperfusion periods three different protocols can be distinguished. After 3 h of reperfusion the expression of cardiac cytokines was measured. After 24 h the myocardial infarct size was assessed by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining, cardiac troponin T concentration was evaluated as marker of infarct size and hemodynamic parameters were recorded. A period of two weeks of reperfusion was again followed by TTC staining and evaluation of infarct size by a planimetry software. In the same group echocardiography and intracardiac catheter measurements were applied to examine cardiac function and hemodynamics.<br /> Animals which had been pre-treated with 5 nmol of CpG-ODN 1668, developed significantly smaller infarct sizes and lower cTNT-concentrations after I/R than the control group. Pre-treatment with other concentrations of 1668 (1, 10 and 20 nmol) did not reduce infarct size. In contrast higher concentrations resulted in an increased mortality up to 80%. Mice pre-treated with 1612- or H154-ODN (sequences without or less CpG-motives) did not show significant reduction of infarct area compared to controls emphasizing that the activation of TLR9 plays a decisive role for the extent of myocardial damage. In addition, the 1668-ODN group tended to show a reduced inflammatory response after I/R as indicated by a decreased cytokine rise. Furthermore, a tendency toward lower diastolic blood pressure and higher ejection fractions could be demonstrated in this group.<br /> These data demonstrate for the first time that CpG oligonucleotides play a role in the ischemia-reperfusion injury. TLR9-mediated CpG-preconditioning results in a reduction of myocardial infarction in a dose- and sequence-dependent manner and causes a decrease of cardial troponin T concentrations. In conclusion, CpG-ODNs may offer a therapeutic potential not only in respect to cancer and infections, but also for the treatment of myocardial infarction.