Modell zur vitalmikroskopischen Biofilmobservation am Beispiel von Streptococcus mutans

Abstract

Schätzungsweise 65 % aller Infektionskrankheiten weltweit gehen auf Biofilme zurück. Zur Bekämpfung dieser Erkrankungen ist das Verständnis der Biofilmentstehung und –entwicklung notwendig. Mit Hilfe der Laserfluoreszenzmikroskopie (CLSM) wurde ein Versuchsaufbau entwickelt, der die dreidimensionale Observation eines vitalen Biofilms über längere Zeiträume erlaubt. Die Untersuchung kommt ohne Zerstörung oder Fixation aus und ermöglicht daher die Beobachtung eines weitgehend natürlichen Biofilms. Mit Hilfe des CLSM werden, ähnlich einer Tomographie, Schnittbilder der Probe angefertigt. Werden diese später zusammengefügt entsteht ein räumliches digitales Abbild der Probe.<br /> Auf sterilen Kammern mit Boden aus Borosilikatglas wurde mit steril gefiltertem Speichel ein Pellikel erzeugt. Die Bildung des Pellikels erfolgte bei 37° C über vier Stunden. Anschließend wurde 1 ml, mit LIVE/DEAD BacLight gefärbte Streptokokkus-mutans-Suspension in die Kammer gegeben. Die Bakterien befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung in der Plateauphase. Die Bakterienzahl blieb also über dem Versuchszeitraum relativ konstant. Mittels CLSM wurde die Probe jede halbe Stunde über einen Zeitraum von fünf Stunden untersucht und Schnittbilder vom Kammerboden bis in eine Höhe von 28 μm oberhalb des Pellikels erstellt. Durch die Färbung konnten tote von lebenden Bakterien unterschieden werden. Der Versuch wurde fünf mal wiederholt und die Schnittbilder mit Hilfe der LSM-Software quantifiziert.<br /> Die erzeugten Biofilme zeigten jeder für sich genommen eine charakteristische Bakteriendichte und Verteilung von toten und lebenden Bakterien, wiesen jedoch untereinander große Unterschiede auf. Allen Versuchen gemein ist ein starker Anstieg der Bakteriendichte mit Maximum in 4 – 12 μm Abstand vom Pellikel und einem drauf folgenden langsamen Abfall. Die Mikroorganismen bilden teilweise stabile und ortständige Aggregate, die auf eine Adhäsion am Pellikel schliessen lassen.<br /> Es konnte gezeigt werden, dass der Biofilm unter Laborbedingungen mit in vivo gewonnenen Biofilmen vergleichbar ist. Der Versuchsaufbau ist also zur Biofilmsimulation und Observation geeignet.