<i>Sclerotinia</i>-induzierte differentielle Genexpression in resistenten <i>Helianthus</i>-Wildarten

Abstract

Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ist ein pertotropher Pilzerreger, der bei der Kultur-sonnenblume, Helianthus annuus L., verheerende Ertragsverluste verursacht. Resistenzen gegen dieses Phytopathogen sind hingegen in einigen Wildarten der Gattung Helianthus vorzufinden. Bis heute sind die molekularen Hintergründe dieser Resistenz jedoch weitestgehend ungeklärt. Um die Resistenzausprägung von Helianthus-Wildarten näher zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit zwei Wildartaccessionen, AC 7 und AC M, phänotypisch, phytochemisch und transkriptomisch auf ihre Resistenz gegen das Pathogen S. sclerotiorum in Gewächshausversuchen untersucht. In diesem Zusammenhang konnte im Vergleich zu der Sclerotinia-anfälligen Kultursorte Albena gezeigt werden, dass in dem untersuchten Zeitraum nach artifizieller Inokulation eine signifikante Reduktion der Läsions-längen in den infizierten Blättern der Wildarten, insbesondere in den ersten 48 h, für die phänotypische Resistenzausprägung der untersuchten Wildarten entscheidend ist. Es konnte weiterhin anhand von qualitativen und quantitativen Analysen chromatographisch demonstriert werden, dass die Wildarten AC 7 und AC M, im Gegensatz zu der Kultur-sonnenblume, über hohe Konzentrationen an phenolischen Inhaltsstoffen verfügen. Zudem resultierte eine Induktion spezifischer phenolischer Verbindungen aus der Infektion durch das Pathogen. In beiden Wildarten erfolgte ein Nachweis von überwiegend Kaffeoylsäure-derivaten in den Blättern der Wildarten AC 7 und AC M, von denen nach Infektion Mono- und Di-Kaffeoylchinasäuren stark vertreten waren. Die Bedeutung des Phenolstoffwechsels für die Interaktion zwischen den Wildarten und dem Pathogen konnte zudem durch den Nachweis der differentiellen Genexpression einer 4-Coumarat-CoA-Ligase (4CL) bestätigt werden. Als weitere hochexprimierte Transkripte wurden eine Cysteinprotease (CP) aus dem Proteinstoffwechsel und das Schlüsselenzym S-Adenosyl-Methionin-Synthetase (SAMS) aus dem Methioninstoffwechsel nachgewiesen. Eine postinfektionelle Suppression wurde für ein Chlorophyll-a/b-bindendes Protein (CAB) aus dem Lichtsammelkomplex des Photosynthese-stoffwechsels belegt. In der Gesamtheit der transkriptomischen Untersuchungen wurde zudem gezeigt, dass eine frühzeitige pathogen-induzierte Genexpression in den Blättern der Wildarten für eine erfolgreiche Pathogenabwehr entscheidend ist. Weiterhin konnten, trotz ähnlichen phänotypischen Läsionsausprägungen, genotypische Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Wildartaccessionen hinsichtlich der Anzahl differentiell exprimierter Transkripte nachgewiesen werden. Durch den Einsatz der Differential Display-Methodik und der kapillargelektrophoretischen Auftrennung der generierten cDNA-Fragmente konnte in dieser Arbeit erstmalig eine Isolation der vier Transkripte (CAB, 4-CL, CP, SAMS) in den Wildarten der Gattung Helianthus erfolgen. Die Verwendung von Datenreduktions-algorithmen zur statistischen Auswertung von Expressionsdaten wurde etabliert, um eine computer-gestützte Auswahl von signifikant differentiell exprimierten Transkripten aus dem mRNA-Pool der Wildarten zu ermöglichen.

<p><i><strong>Sclerotinia</strong></i><strong>-induced differential gene expression in resistant wild species of <i>Helianthus</i></strong><br /> Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary is a necrotrophic pathogen causing devastating yield losses in cultivated sunflower (Helianthus annuus L.). However, resistance to this phytopathogenic fungus exists in some wild sunflower species. Up to date, there is still marginal information on the molecular background of this resistance phenomenon.<br /> In order to go into detail according to the traits of this resistance, two wild sunflower accessions, AC 7 and AC M, were examined in the greenhouse with a major consideration on phenotypical, phytochemical and transcriptomic characteristics. In this regard and in comparison to a Sclerotinia-susceptible cultivated sunflower, it was possible to point out that a significant reduction of the lesion length and delayed disease development, particularly within 24 h, was decisive for resistance in wild species after artificial inoculation with the pathogen. It was demonstrated by means of qualitative and quantitative chromatographic analyses that the leaves of the wild sunflower species, AC 7 and AC M, comprise high concentrations of phenolic compounds in comparison to leaves of the susceptible cultivar Albena. Furthermore, it was shown that the synthesis of specific phenolic substances was induced by the pathogen S. sclerotiorum. The leaves of both wild sunflower accessions mainly included caffeoylic compounds with high concentrations of mono- and di-caffeoyl quinic acids after the infection with S. sclerotiorum.<br /> In addition, the transcriptomic approach revealing differential expression of a transcript with homology to a 4-coumarat-CoA-ligase (4CL) in the wild sunflower species confirmed the importance of the phenolic pathway for the interaction with S. sclerotiorum. An up-regulation after inoculation with S. sclerotiorum was determined for two more transcripts which were isolated and characterised as a cysteine protease (CP) responsible for protein degradation and as an S-adenosyl-methionine-synthetase (SAMS), the key enzyme of the methionine pathway. One down-regulated transcript was confirmed as a chlorophyll-a/b-binding protein (CAB) originating from the light harvesting complex which is involved in photosynthesis. In consideration of the transcriptomic approach the evidence was given that an initial pathogen-induced gene expression is critical for successful pathogen defence in leaves of wild sunflower species. Furthermore, it was shown that despite similar phenotypical characteristics of the lesions, genotypic differences concerning the number of differential expressed transcripts between the two wild sunflower species AC 7 and AC M were detected. By means of the method of differential display combined with the separation of the generated cDNA-fragments via capillary gel electrophoresis the isolation of the four transcripts (CAB, 4-CL, CP, SAMS) from wild sunflower species was first accomplished in this study. The application of data reduction algorithms for the statistical analysis of gene expression data was established to enable the computer-assisted selection of significant differentially expressed transcripts from the mRNA-pool of the wild sunflower species.</p>