Untersuchungen zur Rolle der ZIPK und der Bedeutung der Histon H3-Thr11-Phosphorylierung in der Mitose

Abstract

Die ZIPK ist eine Serin/Threonin-Kinase die in verschiedene zelluläre Prozesse, wie die Regulation der Transkription, Zellmotilität, Apoptose und Mitose involviert ist. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit zwei Aspekten. Zum einen wurde die Lokalisation der ZIPK in der Mitose und zum anderen die Bedeutung der Histon H3- Thr11-Phosphorylierung untersucht.<br /> Es konnte bestätigt werden, dass die humane ZIPK wie die murine ZIPK mit den Zentrosomen, den Zentromeren, dem kontraktilen Ring und dem Mittelkörperchen assoziiert ist. Die Assoziation der humanen ZIPK an den Zentromeren konnte auf das äußere Kinetochor begrenzt sowie eine Lokalisation mit der Zentralspindel am Metaphase-Anaphase-Übergang beobachtet werden. Damit ähnelt die Lokalisation der ZIPK in der Mitose der Wanderung des Chromosomal Passenger Komplexes (CPC). Eine direkte Beziehung zwischen Aurora-B oder INCENP, beides Komponenten des CPCs, konnten jedoch nicht festgestellt werden.<br /> Um die mitotische Funktion der ZIPK genauer untersuchen zu können, sollte ein System zur Herunterregulation der ZIPK mithilfe von RNAi etabliert werden. Jedoch konnte weder durch die Transfektion von siRNA, noch über die plasmidbasierte Expression von shRNA das Expressionslevel der ZIPK ausreichend reduziert werden.<br /> Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der mitotischen Phosphorylierung von Histon H3 am Thr11. Detailliertere Untersuchungen ergaben, dass diese zentromerspezifische H3-Modifikation in der späten G₂-Phase kurz vor dem Eintreten der Zelle in die Mitose und zwar bereits vor der Phosphorylierung von H3 am Ser10 erfolgt. Mithilfe eines Screenings verschiedener Kinaseinhibitoren konnten zwei potenzielle Kinasen identifiziert werden, die an der Thr11-Phosphorylierung beteiligt sind. Während die Inhibition von PRK2 eine verminderte Thr11-Phosphorylierung zur Folge hatte, führte die Inhibition von Plk1 zu einer Verstärkung der zentromerspezifischen Thr11-Phosphorylierung. Ob die ZIPK <i>in vivo</i> an der Phosphorylierung von H3 am Thr11 beteiligt ist, konnte weder bestätigt noch ausgeschlossen werden.<br /> Um die Funktion dieser Modifikation zu ermitteln wurden stabil transfizierte Zelllinien verwendet, die eine Mutante (T11A oder T11D) bzw. das WT-Protein von H3 als GFP-Fusionsprotein exprimieren. Bei beiden Mutantenzelllinien (T11A-GFP und T11D-GFP) wurde ein verlangsamtesWachstum beobachtet. Durch <i>Live-Cell-Imaging</i>- Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass das auf eine Verzögerung in der Pro- und Metaphase zurückzuführen ist, was auf eine Aktivierung des Spindelkontrollpunktes hindeutet. Außerdem wurde in diesen Zelllinien eine um das 3-4-fach erhöhte Anzahl an Zellen mit freien Chromosomen in der Metaphase beobachtet, ein Pänotyp der auch auftritt wenn die Thr11-Phosphorylierung durch Inhibition von PRK2 ausfällt. Die Phosphorylierung von H3 am Thr11 könnte deshalb - entweder direkt oder indirekt - an der Regulation der Kinetochor-Mikrotubuli-Interaktion beteiligt sein.