Etablierung Zell-permeabler Varianten der Transkriptionsfaktoren Oct4 und Sox2 und die Untersuchung ihrer Rollen in der Pluripotenzerhaltung von murinen embryonalen Stammzellen

Abstract

Die Transkriptionsfaktoren Oct4 und Sox2 sind zwei Hauptregulatoren der Pluripotenz embryonaler Stammzellen (ES-Zellen), deren Interaktion weitere Pluripotenz-erhaltende Faktoren aktiviert bzw. Differenzierungsfaktoren reprimiert. Um die Modulation von Stammzelleigenschaften ohne genetische Modifikation zu ermöglichen, wurden in dieser Arbeit Zell-permeable Varianten der beiden Faktoren hergestellt. Durch die Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne wurde der direkte Transfer der Proteine in die Zielzellen ermöglicht. Um die optimale Anordnung der Fusionsdomänen zu ermitteln, wurde ein modulares Expressions-Vektorsystem (pSESAME) etabliert. Mit diesem System können die Transduktions- und Aufreinigungspeptide wahlweise N- oder C-terminal an das Genprodukt des Zielgens fusioniert werden, je nach Einfluss auf die Löslichkeit und Stabilität des Produkts.<br /> Mit Hilfe des pSESAME Vektorsystems wurden transduzierbare Varianten von Oct4 (Oct4TH) und Sox2 (Sox2NTH) rekombinant hergestellt. Beide Fusionsproteine spiegeln die Eigenschaften der endogenen Faktoren in der DNA-Bindung an eine spezifische Zielsequenz wieder. Durch die Markierung des rekombinanten Oct4 bzw. Sox2 mit Rhodamin konnte die Aufnahme der Proteine in die Zelle visualisiert werden. Eine optische Sektion der Zellen ermöglichte darüber hinaus die Detektion der markierten Proteine im Zellkern.<br /> Die Anwendung der Zell-permeablen Faktoren auf ES-Zellen führte zu einem erhöhten Anteil an undifferenzierten Zellen, was durch die zusätzliche Aktivierung einiger Pluripotenzfaktoren zu erklären ist.<br /> Ein RNAi-vermittelter <i>knock down </i>von<i> Oct4</i> in ES-Zellen führte zum Verlust der Selbsterneuerung. Ein <i>Sox2-knock down</i> resultierte außerdem in epithelialer Differenzierung der Zellen Der Phänotyp des <i>knock down</i> konnte in beiden Fällen mit dem entsprechenden transduzierbaren Faktor partiell kompensiert werden.<br /> Da Oct4 und Sox2 zusammen mit Klf4 und c-Myc im Stande sind, Pluripotenz in adulten Zellen zu induzieren, wurde der Einfluss von Oct4 und Sox2 auf Maus-Fibroblasten untersucht. Bei der Applikation von transduzierbarem Sox2 wurde die Aktivierung der Expression eines weiteren Pluripotenzfaktors, <i>Nanog</i>, beobachtet.