Requardt, Robert Pascal: Erzeugung und Analyse einer Mausmutante zur Aufklärung der Funktion der ZO-1-Bindedomäne des Connexin43-Proteins. - Bonn, 2009. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-16752
@phdthesis{handle:20.500.11811/4036,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-16752,
author = {{Robert Pascal Requardt}},
title = {Erzeugung und Analyse einer Mausmutante zur Aufklärung der Funktion der ZO-1-Bindedomäne des Connexin43-Proteins},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2009,
month = feb,

note = {Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine transgene Mauslinie, welche das mutierte Connexin43 (Cx43D378) konditional exprimieren kann, erzeugt. Mittels des Zielvektors „Cx43D378stopKI“ konnte der Austausch der Cx43 kodierenden Region gegen die Cx43D378stop-Ablationsmutante durch homologe Rekombination erfolgreich in HM1 embryonalen Stammzellen der Maus erreicht werden. Der Vektor enthielt, von zwei loxP-Stellen flankiert, die Gja1WT kodierende DNS, eine Neomyzin-Resistenzkassette, die Gja1D378stop kodierende DNS und die eGFP-cDNS, die beide durch eine IRES verbunden sind. Durch die Injektion homolog rekombinierter ES-Zellklone in Blastozysten wurde mit Hilfe von chimären Mäusen, die die Cx43D378stop-Mutation über ihre Keimbahn an ihre Nachkommen vererbten, die transgene Cx43D378stop Mauslinie etabliert.
Durch die Verwendung des konditionalen Vektors war es möglich, das Cx43D378-Protein durch die Verwendung verschiedener gewebespezifischer Cre-Rekombinasen gezielt zu exprimieren und zu untersuchen. Das Reporterprotein eGFP diente dabei der Kontrolle der Expression des Cx43D378stop-Proteins. Da die Gene für beide Proteine auf einer bizistronischen mRNA liegen, die durch eine Interne Ribosomen-Eintrittsstelle verbunden sind, werden sie gemeinsam exprimiert.
Im Gegensatz zu Cx43del/K258stop-Mäusen sind Cx43del/flD378stop:αMHC-Cre-Tiere nicht lebensfähig und sterben innerhalb von 48 Stunden nach der Geburt. Gleiches trifft für homozygote Cx43flD378stop flD378stop:αMHC-Cre-Tiere zu. Die bisherigen Ergebnisse belegen die essentielle Bedeutung der Interaktion zwischen Cx43 und ZO-1 im Mausherzen.
Weiterhin wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Expression der Cx43(Δ234-243)-, der Cx43(Δ253-256)- und Cx43D378stop-Ablationmutanten in HeLa-Zellen erreicht und charakterisiert.
In HeLaCx43(Δ234-243)-Zellen, die eine Cx43-Isoform exprimieren, der die Tubulin-Interaktionsdomäne fehlt, wurde im Vergleich zu Cx43WT exprimierenden Zellen eine stark reduzierte Kopplung zwischen den benachbarten Zellen nachgewiesen. Das Vorhandensein einer geringen Restkopplung weist darauf hin, dass es neben der Tubulin-Bindedomäne eine weitere für den Transport des Cx43(Δ234-243)-Proteins zuständige Interaktion geben muss. Dieser Transport muss nicht unbedingt Mikrotubulizytosklett abhängig sein.
An Cx43(Δ253-256)-HeLa-Zellen, in denen die Interaktion zwischen Cx43 und CIP85 durch die Ablation der Interaktionsdomäne des Cx43 verhindert ist, wurde eine stark eingeschränkte Kopplung im Vergleich zu Cx43WT-Kanälen gefunden. Die erhöhte zytoplasmatische Expression des Cx43(Δ253-256)-Proteins und erste Hinweise auf eine verlängerte Halbwertszeit scheinen die Wichtigkeit der CIP85 Bindedomäne beim lysosomalen Abbau des Cx43-Proteins zu bestätigen.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/4036}
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