Heterogenität humaner 5-HT3-RezeptorenPharmakologische Charakterisierung homopentamerer 5-HT3A-, heteromerer 5-HT3A/B(C,D,E)-Rezeptoren und natürlich vorkommender 5-HT3-Rezeptorvarianten
Heterogenität humaner 5-HT3-Rezeptoren
Pharmakologische Charakterisierung homopentamerer 5-HT3A-, heteromerer 5-HT3A/B(C,D,E)-Rezeptoren und natürlich vorkommender 5-HT3-Rezeptorvarianten
dc.contributor.advisor | Bönisch, Heinz | |
dc.contributor.author | Walstab, Jutta | |
dc.date.accessioned | 2020-04-13T22:52:54Z | |
dc.date.available | 2020-04-13T22:52:54Z | |
dc.date.issued | 07.04.2009 | |
dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/20.500.11811/4052 | |
dc.description.abstract | Der 5-HT3-Rezeptor ist innerhalb der Familie der Serotonin (5-HT)-Rezeptoren der einzige ligandgesteuerte Ionenkanal. Er zählt zur Superfamilie der Cys-loop-Rezeptoren und setzt sich aus fünf konzentrisch um eine kationenpermeable (Na+, Ca2+, K+) Pore angeordnete Untereinheiten zusammen. Er ist in die Pathogenese psychiatrischer Erkrankungen involviert. Weiterhin spielt er eine wichtige Rolle bei der Steuerung gastrointestinaler Funktionen und 5-HT3-Rezeptorantagonisten werden erfolgreich in der Therapie der Chemo-/Radiotherapie-induzierten bzw. postoperativen Emesis eingesetzt. Das Hauptziel der Arbeit war die Untersuchung der Heterogenität des 5-HT3-Rezeptorsystems, was für die Aufklärung der pathophysiologischen Rolle dieser Rezeptoren essenziell ist. Zunächst galt es, eine Methode zu optimieren, die es im Gegensatz zur Patch-Clamp-Technik ermöglicht, 5-HT3-Rezeptoren unterschiedlicher Zusammensetzung schnell funktionell zu charakterisieren. Die Methode basiert auf dem Agonist-induzierten Ca2+-Influx durch den 5-HT3-Rezeptorkanal und der daraufhin ausgelösten Ca2+-abhängigen Lumineszenz des Fotoproteins Aequorin. Die Optimierung erfolgte an heterolog exprimierten 5-HT3A-Rezeptoren in HEK293-Zellen, welche nachweislich keine Expression nativer 5-HT-Rezeptoren bzw. spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle aufwiesen. Anhand ermittelter pharmakologischer Kenngrößen von Rezeptorliganden, welche denen mittels anderer Methoden bestimmten entsprachen, wurde demonstriert, dass der Aequorin-Assay eine sensitive, für die Hochdurchsatzanalyse geeignete Methode zur Charakterisierung Ca2+-permeabler ligandgesteuerter Ionenkanäle ist. Mittels rekombinanter PCR-Technik wurden fluoreszenzmarkierte 5-HT3A-Untereinheiten für die Untersuchung der Interaktion ligandgesteuerter Ionenkanäle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), generiert. Die Membran-expression der zwei 5-HT3A-ECFP/EYFP-Fusionskonstrukte in HEK293-Zellen war im Vergleich zum unmarkierten Rezeptor reduziert. Deren Funktionalität konnte zwar elektrophysiologisch aber nicht im Ca2+-Influx-Assay gezeigt werden, was eine stark reduzierte Ca2+-Permeabilität aufgrund der beträchtlichen Größe der Fluoreszenzproteine impliziert. Demgegenüber zeigte der mit dem Fluorescein Arsenical Hairpin Binder (FlAsH)-Motiv von nur zwölf Aminosäuren (AS) markierte 5-HT3A-Rezeptor neben einer geringfügig reduzierten Membranexpression keine veränderte Funktion im Vergleich zum unmarkierten 5-HT3A-Rezeptor. Bisher sind fünf 5-HT3-Untereinheiten bekannt (A - E), wobei nur die A-Untereinheit in der Lage ist, funktionelle homopentamere Rezeptoren auszubilden. Die anderen Untereinheiten gelangen nur zusammen mit der A-Untereinheit an die Zelloberfläche, um funktionelle heteromere Rezeptoren mit dieser zu formen. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass homopentamere 5-HT3A- neben heteromeren 5-HT3A/B-Rezeptoren in transient transfizierten HEK293-Zellen exprimiert werden. Daraus ergibt sich das grundsätzliche Problem der funktionellen Charakterisierung heteromerer 5-HT3A/X-Rezeptoren, die nicht von den 5-HT3A-Rezeptoren separiert werden können. Bekannt ist, dass die Ligandbindungsstelle des 5-HT3-Rezeptors im N-Terminus durch eine „Hauptuntereinheit“ und eine benachbarte „komplementäre“ Untereinheit gebildet wird. Mit Hilfe der mutierten 5-HT3A W178S-Untereinheit, die bei erhaltener Oberflächenexpression keine Ligandbindung mehr ermöglicht, konnte in Radioligandbindungsversuchen demonstriert werden, dass die neuen 5-HT3-Untereinheiten C, D und E nicht als „Hauptuntereinheit“ an der Ligandbindung beteiligt sein können. Der Hauptteil dieser Arbeit bestand in der Untersuchung der Auswirkungen natürlich vorkommender Varianten einzelner 5-HT3-Untereinheiten und einer Spleißisoform auf die Funktion und Expression homopentamerer 5-HT3A- bzw. heteromerer 5-HT3A/B(C,D,E)-Rezeptoren. Deren pharmakologische Charakterisierung erfolgte durch [3H]GR65630-Bindung und Ca2+-Influx-Analysen. Keine der untersuchten Varianten führte zu veränderten Affinitäten / Potenzen getesteter Liganden an den jeweiligen Rezeptoren im Vergleich zum Wildtyp (WT). Dagegen verursachten die A-Varianten A33T und R344H, die B-Variante V183I, die C-Variante 163N und die Spleißisoform Ea eine reduzierte Membranexpression des entsprechenden 5-HT3A- bzw. 5-HT3A/X-Rezeptors. Das deutet auf einen negativen Einfluss auf Rezeptorsynthese, -assemblierung oder -trafficking hin und resultiert womöglich in einer verminderten 5-HT3-Rezeptorsignaltransduktion in vivo. Die verminderte Oberflächenexpression der 5-HT3A R344H-Variante wurde nicht von einer entsprechenden Verringerung des 5-HT-induzierten Maximaleffektes im Ca2+-Influx begleitet, was unter Umständen auf die in elektrophysiologischen Messungen bestimmte längere mittlere Kanalöffungsdauer im Vergleich zum WT zurückgeführt werden kann. Demgegenüber führten die B-Varianten Y129S und S156R bei fehlendem Einfluss auf die Membranexpression zu stark erhöhten 5-HT-induzierten Maximaleffekten an den jeweiligen 5-HT3A/B-Rezeptoren, was einen Einfluss der Aminosäureaustausche auf die Kanaleigenschaften impliziert und unter Umständen in vivo zu einer verstärkten 5-HT3-Rezeptorsignaltransduktion führt. Die Untersuchung des Einflusses der Varianten auf Expression oder Funktion des 5-HT3-Rezeptors liefert die Grundlage zur Erklärung gefundener Assoziationen mit psychiatrischen Erkrankungen. So sind möglicherweise die Assoziationen der häufigen B-Varianten Y129S und V183I mit unipolarer (Y129S) und bipolarer (beide) Depression auf die veränderte 5-HT3-Signaltransduktion zurückzuführen. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde der Einfluss von RIC-3 auf die Expression und Funktion verschiedener 5-HT3-Rezeptoren untersucht. RIC-3 ist ein ursprünglich in C. elegans identifiziertes Chaperon, welches spezifisch die Maturation nikotinischer Acetylcholin (nACh)- und 5-HT3-Rezeptoren beeinflusst. RIC-3 hatte keinen Einfluss auf die Konzentrations-Wirkungsbeziehung von 5-HT am 5-HT3A-Rezeptor. Demgegenüber führte das Chaperon nach Koexpression mit 5-HT3-Rezeptoren unterschiedlicher Zusammensetzung zu einer differentiellen Erhöhung der Membranexpression dieser Rezeptoren, wobei das Ausmaß der Erhöhung von der eingesetzten RIC-3-cDNA-Menge bei der Transfektion abhängig war. Dies ist ein Hinweis darauf, dass RIC-3 bei der Regulierung der 5-HT3-Rezeptorzusammensetzung in vivo eine Rolle spielt. | |
dc.language.iso | deu | |
dc.rights | In Copyright | |
dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ | |
dc.subject | Aequorin | |
dc.subject | Serotoninrezeptor | |
dc.subject | Variante (Medizin) | |
dc.subject | Emesis | |
dc.subject | Reizdarm-Syndrom | |
dc.subject | Chaperone | |
dc.subject | RIC-3 | |
dc.subject | serotonin receptor | |
dc.subject | variant (medicine) | |
dc.subject | irritable bowel syndrome | |
dc.subject | chaperones | |
dc.subject.ddc | 540 Chemie | |
dc.subject.ddc | 610 Medizin, Gesundheit | |
dc.title | Heterogenität humaner 5-HT3-Rezeptoren | |
dc.title.alternative | Pharmakologische Charakterisierung homopentamerer 5-HT3A-, heteromerer 5-HT3A/B(C,D,E)-Rezeptoren und natürlich vorkommender 5-HT3-Rezeptorvarianten | |
dc.type | Dissertation oder Habilitation | |
dc.publisher.name | Universitäts- und Landesbibliothek Bonn | |
dc.publisher.location | Bonn | |
dc.rights.accessRights | openAccess | |
dc.identifier.urn | https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-16986 | |
ulbbn.pubtype | Erstveröffentlichung | |
ulbbnediss.affiliation.name | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | |
ulbbnediss.affiliation.location | Bonn | |
ulbbnediss.thesis.level | Dissertation | |
ulbbnediss.dissID | 1698 | |
ulbbnediss.date.accepted | 07.04.2009 | |
ulbbnediss.fakultaet | Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät | |
dc.contributor.coReferee | Mohr, Klaus |
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E-Dissertationen (4074)