Identifikation und Charakterisierung von Interaktionspartnern des Proteins Polyduktin

Abstract

Die Autosomal-recessive polyzystische Nierenerkrankung ist eine der bedeutensten Nephropathien im Kindesalter. Die meisten Patienten präsentieren bereits <i>in utero</i> bilateral vergrößerte zystische Nieren und eine kongenitale Leberfibrose.<br /> Das für die Erkrankung verantwortliche Gen PKHD1 (polycystic kidney and hepatic disease 1) umfasst 470 kb genomischer DNS und besteht aus 86 Exons, die für ein komplexes Muster von Spleißvarianten kodieren.<br /> Der längste offene Leserahmen kodiert für ein Transkript von 12,2 kb und besteht aus 67 Exons. Das Genprodukt Polyduktin ist ein Typ I-Membranprotein von 4074 Aminosäuren mit einem großen N-terminalen Bereich und einem kurzen cytoplasmatischen C-Terminus. Der cytoplasmatische Bereich enthält vier potentielle Phosphorylierungsstellen, die möglicherweise in die Signaltransduktion involviert sind.<br /> Die Funktion von Polyduktin ist bislang ungeklärt. Um interagierende Proteine von Polyduktin zu identifizieren wurde ein Hefe-zwei-Hybrid-Screen mit den cytoplasmatischen Aminosäuren 3881 bis 4074 von Polyduktin als Köder und einer humanen fötalen Nieren-cDNS-Bibliothek durchgeführt. Der experimentelle Ansatz führte zur Isolierung von vier Klonen die mit Polyduktin interagieren.<br /> Bei dem ersten potentiellen Interaktionspartner handelt es sich um "Mixed lineage leukaemia translocated to 10" (MLLT10) einem Transkriptionsfaktor, dessen Funktion bislang ungeklärt ist. Aufgrund der Expression von MLLT10 in der Niere und die Möglichkeit einer physische Interaktion mit dem C-Terminus von Polyduktin nach dessen proteolytischen Spaltung und Translokation in dem Kern, ist MLLT10 ein interessanter Kandidat.<br /> Der zweite Interaktionspartner ist der "Natriuretische Peptid Rezeptor 1" (NPR1). Mittels Hefe-zwei-Hybrid-Versuchen mit verschiedenen NPR1-Mutanten wurde der Bereich der Interaktion auf die Aminosäuren 985 bis 1010 von NPR1 eingegrenzt. Diese Interaktion wurde sowohl mittels eines quantitativen α-Galactosidase-Aktivitäts-Test als auch mit einem a-Galactosidase-Aktivitäts-Test verifiziert. Die Möglichkeit einer Interaktion <i>in vivo</i> ist gegeben, da NPR1 in den distalen Tubuli und Sammelrohren exprimiert wird und es sich um ein Membranprotein handelt, dessen ermittelte Interaktionsoberfläche ins Cytoplasma ragt. Eine Interaktion zwischen NPR1 und Polyduktin könnte eine Rolle bei Wachstum und Entwicklung der distalen Tubuli und der Sammelrohre übernehmen. Außerdem könnte eine fehlende Interaktion für die beobachtete Hypertonie der ARPKD-Patienten verantwortlich sein.<br /> Ein weiterer Interaktionspartner ist die "Komplement Komponente-7" (C7). Der für die Interaktion benötigte Bereich wurde mittels Hefe-zwei-Hybrid-Experimenten und Protein-Interaktionsstudien auf die Aminosäuren 645 bis 843 von C7 eingegrenzt. C7 ist eine Komponente des Membranangriffskomplexes, welches nicht nur in die Membran integriert werden kann, sondern auch Signaltranduktionswege beeinflusst. Die Daten dieser Arbeit sind ein ersten Hinweis auf eine kausale Involvierung von C7 bei polyzystischen Nierenerkrankungen. <br /> Der letzte und interressanteste Interaktionspartner, der identifiziert werden konnte ist Uromodulin. Das Protein ist eines der für glomerulozystische Nierenerkrankung verantwortlichen Proteine und auch für MDCK2 und FJHN verantwortlich. <br /> Hefe-zwei-Hybrid-Experimente und GST-Proteininteraktionsstudien konnten den Bereich von Uromodulin, der für die Bindung benötigt wird, auf Aminosäuren 419 bis 444 eingrenzen. Immunohistochemische Untersuchungen auf humanem Nierengewebe verschiedener Entwicklungsstufen ergaben, dass Uromodulin bereits in der 15. Schwangersschaftswoche exprimiert wird, was eine Interaktion mit Polyduktin, das ebenfalls bereits in der 15. Schwangerschaftswoche exprimiert wird, während der Embryonalentwicklung zulässt. Eine Interaktion während der Organogenese könnte für die regelrechte Entwicklung der Niere von Bedeutung sein. Immunohistochemische Untersuchungen von ARPKD-Patienten ergaben, dass Abbruchmutationen in PKHD1 und dem damit entstehenden trunkierten Polyduktin eine signifikant erniedrigte Uromodulin-Menge an der Membran zur Folge hat. Möglicherweise spielt Polyduktin eine Rolle bei der Prozessierung von Uromodulin und ist für die richtige Lokalisation des Proteins verantwortlich.<br /> Diese Arbeit zeigt erstmalig, dass Polyduktin und Uromodulin interagieren und Teil eines gemeinsamen Signalwegs sind, der in zystischen Nierenerkrankungen verschiedener Ätiologien gestört sein könnte.