Untersuchung der Heparinwirkung an Adhäsionsrezeptoren mithilfe akustischer Biosensoren

Abstract

Das Antikoagulans Heparin zeigte in verschiedenen klinischen Studien einen Überlebensvorteil bei Krebspatienten, die zu Beginn der Therapie noch nicht unter der Ausbreitung von Metastasen litten. Da in verschiedenen in vitro- und in vivo-Studien eine Beteiligung der Adhäsionsrezeptorfamilie der Selektine am Prozess der hämatogenen Metastasierung bewiesen werden konnte, erschien die Inhibition Selektin-vermittelter Prozesse als Basis der antimetastatischen Wirkung von Heparin.<br /> Die kinetischen Besonderheiten einer Bindung von Heparin an Selektinen wurden mithilfe der Quarzmikrowaage, einem akustischen Biosensor untersucht. Dabei konnten Bindungskinetiken sowohl unfraktionierter Heparine als auch fraktionierter Heparine an P- und L-Selektin erstmals erhoben werden. Anhand der Daten ließ sich ableiten, dass die gute Selektinbindungsfähigkeit des Heparins durch eine im Vergleich zu den nativen Selektinliganden langsamere Dissoziation vom Rezeptor erfolgt. Der Einfluss der Sulfatierung auf die Inhibitionspotenz konnte mithilfe semisynthetischer Glucansulfate mit definierter chemischer Zusammensetzung bestimmt werden. Es zeigte sich, dass sich ein steigender Sulfatierungsgrad sowohl in einer schnelleren Assoziation als auch in einer langsameren Dissoziation und damit einer höheren Affinität äußert. Die Korrelation der kinetischen Werte mit Daten eines funktionellen Zelladhäsion-Inhibitionsassays unterstrich die besondere Bedeutung der Dissoziationskonstanten glykosidischer Selektin-Inhibitoren.<br /> Mithilfe der Quarzmikrowaage wurde die Funktion des Sulfatids SM4 als Selektinligand im Rahmen der Metastasierung anhand verschiedener Modellsysteme untersucht. Dabei zeigte sich, dass SM4, ähnlich wie das native Selektin-Bindungsepitop sLex in Modellmembranen konzentrationsabhängige Clusterstrukturen ausbildet. Derartige Ligandanhäufungen stellen bei der Selektinbindung ein Prinzip der Aviditätserhöhung für die schwach affinen Liganden dar und tragen so zum metastatischen Potential Selektinligand-exprimierender Zellen bei. Mithilfe von SM4-tragenden Liposomen konnte gezeigt werden, dass auch die SM4-Selektin-Wechselwirkung durch fraktionierte und unfraktionierte Heparine gehemmt werden kann.<br /> Neben Selektinen spielen auch Adhäsionsrezeptoren der Familie der Integrine eine Rolle bei der hämatogenen Metastasierung. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Wechselwirkung des Integrins VLA-4 (Integrin alpha4-beta1) mit seinem natürlichen Liganden VCAM-1 gelegt. Mithilfe eines akustischen Oberflächenwellensensors konnte gezeigt werden, dass die Adhäsion VLA-4-exprimierender MV3-Zellen an immobilisiertem VCAM-1 durch Heparin in ähnlichem Ausmaß gehemmt werden kann wie durch den VLA-4-bindenen Antikörper Natalizumab. Mithilfe einer Membranpräparation von MV3-Zellen konnten VLA-4-haltige Membranvesikel auf Sensorchips eines akutstischen Oberflächenwellensensors immobilisiert werden und kinetische Daten für die Bindung von VCAM-1-Fc-Chimären, Natalizumab und dem niedermolekularen Heparin Tinzaparin bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass Tinzaparin VLA-4 mit einer Affinität im mikromolaren Bereich zu binden vermag. Dies ist ein weiterer Hinweis auf die Inhibitionspotenz von Heparin in diesem metastasierungsrelevanten Zelladhäsionsmechanismus.<br /> Die erhobenen Daten demonstrieren einmal mehr das metastasierungssenkende Potential von Heparin in der begleitenden Therapie onkologischer Patienten und stellen die Bedeutung der Bindungskinetik potentieller Adhäsionsrezeptor-Inhibitoren heraus.