HPLC-IMER as a Fast and Sensitive Method for the Determination of Sulfur Dioxide in Foodstuffs

Abstract

HPLC-IMER (HPLC with an immobilized enzyme reactor) is a combination of an isocratic HPLC system with an integrated immobilized enzyme reactor and electrochemical detection for the analysis of sulfites. The aim of this work was to optimize the HPLC-IMER method for different food matrices, to compare different sulfite oxidases, and to compare the HPLC-IMER with the official method for sulfite analysis. <br /> Several HPLC-IMER parameters were optimized, with a focus on an effective sample preparation for different foodstuffs. With a programmable autosampler, the effects of different parameters (reaction times of water, carbonate buffer, and sodium hydroxide) on the release of bound sulfites were studied. It was found that treatment with sodium hydroxide is essential in the release of bound sulfites, with longer reaction times required for samples rich in anthocyanins. <br /> For the first time, an enzyme reactor with plant sulfite oxidase from <i>Arabidopsis thaliana</i> was employed in biosensor analysis, and its performance was compared with the animal sulfite oxidase from chicken liver (EC 1.8.3.1). The novel plant sulfite oxidase has a much broader linear range (0.04 up to more than 20 mg/L) than the animal enzyme (0.04 - 0.8 mg/L). Furthermore, the immobilized enzyme from <i>Arabidopsis thaliana</i> was shown to be a lot more stable in the course of many analyses. Thus, regarding the application in HPLC-IMER, the plant sulfite oxidase is superior to the animal sulfite oxidase. <br /> The general applicability of the HPLC-IMER for a number of different foodstuffs was shown. Many samples like fruit juices, fruit nectars, sugar sirups, jelly, wine and smoothies were successfully analyzed. In a storage study over seven months, the alteration of sulfite contents in a commercial red grape juice was examined with the HPLC-IMER. <br /> The optimized HPLC-IMER method was compared to the official distillatory method of sulfite analysis (IFU 7a) and the newly developed DE-HPLC-IMER in the diploma thesis of Kothe. In almost all cases, the HPLC-IMER leads by far to the highest sulfite findings. The results for sulfite contents are up to 100% above those of the IFU 7a and the DE-HPLC-IMER. Additionally, the HPLC-IMER method generally shows a significantly lower detection limit, as well as a lower standard deviation. <br /> After all, this method has many advantages compared to the official methods, as it is not only more sensitive and precise, but also simple to perform, automatable and fast.

<strong>HPLC-IMER als schnelle und empfindliche Methode zur Bestimmung von Schwefeldioxid in Lebensmitteln</strong><br /> Die HPLC-IMER (HPLC mit immobilisiertem Enzymreaktor) ist eine Kombination aus einem isokratischen HPLC-System und einem integrierbaren Enzymreaktor zur empfindlichen Analyse von Sulfiten in Lebensmitteln. Ziel dieser Arbeit war eine Optimierung dieser Methode für verschiedene Probenmatrizes, der Vergleich unterschiedlicher Sulfitoxidasen und der Vergleich der HPLC-IMER mit der offiziellen Methode zur Sulfitanalytik. <br /> Ein Schwerpunkt lag auf der Probenaufarbeitung für unterschiedliche Lebensmittel. Ein programmierbarer Autosampler ermöglichte die reproduzierbare Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Parameter auf die Wiederfindung (z. B. Behandlung mit Wasser, Carbonatpuffer oder Natronlauge mit unterschiedlich langen Einwirkzeiten). Für die meisten Proben ist eine Vorbehandlung mit Natronlauge essenziell zur Freisetzung der gebundenen Sulfite. Dabei zeigte sich, dass die nötige Einwirkzeit für Lebensmittel mit hohen Anthocyangehalten länger ist als für andere Proben. <br /> Zum ersten Mal wurde in der Analytik von SO₂ ein Enzymreaktor mit pflanzlicher SOx aus <i>Arabidopsis thaliana</i> eingesetzt und mit tierischer Sulfitoxidase verglichen. Der lineare Bereich der bereits zuvor in der Biosensor-Analytik eingesetzten tierischen SOx (0.04 bis 0.8 mg/L SO₂) aus Hühnerleber (EC 1.8.3.1) wird von dem pflanzlichen Enzym weit übetroffen (0.04 bis über 20 mg/L SO₂). Darüber hinaus zeigt sich die immobilisierte pflanzliche SOx auch durch ihre bessere Stabilität der tierischen überlegen. <br /> Die Praxistauglichkeit der optimierten HPLC-IMER mit pflanzlichem Enzymreaktor wird für eine große Anzahl verschiedener Lebensmittelproben demonstriert: diverse Fruchtsäfte, Nektare, Zuckersirupe, Gelee, Wein und Smoothies wurden erfolgreich untersucht. <br /> Ein Lagerversuch mit rotem Traubensaft zeigte die Veränderung des Sulfitgehaltes über einen Zeitraum von mehr als sieben Monaten. <br /> Die optimierte HPLC-IMER wird in der Diplomarbeit von Kothe mit der offiziellen Methode für die Bestimmung von Schwefeldioxid in Fruchtsäften (IFU 7a) und mit der im Rahmen dieser Arbeit neu entwickelten DE-HPLC-IMER verglichen. Dabei führt die HPLC-IMER in fast allen Fällen zu den höchsten Wiederfindungsraten für Sulfit. Die gefundenen Werte liegen bis zu 100% über denen der anderen beiden Methoden. Des Weiteren sind sowohl die Nachweisgrenze als auch die Standardabweichung der HPLC-IMER deutlich niedriger als die der destillativen Methoden. <br /> Insgesamt zeigt die HPLC-IMER zahlreiche Vorteile gegenüber den etablierten Methoden. Sie ist nicht nur empfindlicher und genauer, sondern auch automatisierbar, schnell und einfach durchführbar.