Funktionelle Untersuchungen der Multidrug-Resistance-Associated Proteins (MRP) 1 und 2

Abstract

Die Multidrug-Resistenz (MDR) stellt ein ernstzunehmendes Problem in der Therapie maligner Tumore dar. Eine Ursache dieses MDR-Phänotyps ist die Überexpression von Multidrug resistance associated proteins (MRPs), insbesondere MRP1 und MRP2. MRP1 und MRP2 sind in der Lage eine Vielzahl an konjugierten und unkonjugierten Verbindungen, darunter viele Zytostatika, unter ATP-Verbrauch aus der Zelle zu entfernen und so eine Resistenz auszulösen. Ziel dieser Arbeit war es neue Modulatoren zur Aufhebung der MRP1 und MRP2 induzierten MDR zu finden und zu charakterisieren. Dazu wurden verschiedene auf überexprimierenden Zellen basierende Akkumulations-Assays entwickelt, etabliert oder bereits bestehende modifiziert und angewendet, um die Eigenschaften neuer Modulatoren zu charakterisieren. Als besonders effektiv erwies sich der neu etablierte und modifizierte Calcein-AM-Assay für MRP1 und MRP2 durch den einige neue Modulatoren identifiziert werden konnten. Um die Selektivität der neu entdeckten Modulatoren zu untersuchen, wurde zusätzlich der bereits etablierte Calcein-AM-Assay für P-gp angewendet. <br /> Als neue Klasse von Inhibitoren wurden unter anderem Benzimidazolderivate entdeckt. Sie hemmen den Transport durch MRP1, MRP2 und P-gp, wobei eine hohe Korrelation der Effektivitätsdaten zwischen den Transportern nachgewiesen werden konnte. Dies weist auf einen hohen Verwandtschaftsgrad aller drei Transporter hin. Die inhibitorisch aktivsten Substanzen sind im unteren mikromolaren Bereich an allen Resistenzproteinen wirksam. Durch Einsatz der 3D-QSAR-Methoden CoMFA und CoMSIA konnten zusätzlich aussagekräftige Modelle zur Beschreibung der Strukturwirkungsbeziehungen für MRP1, MRP2 und P-gp generiert werden. Die Strukturwirkungsbeziehungen ließen sich am besten durch sterische bzw. hydrophobe Wechselwirkungen beschreiben und zeigten einen hohen Verwandtschaftsgrad der drei Resistenzproteine. <br /> Als weitere Klasse von neuen Modulatoren erwiesen sich die ortho-Thioureidocarbonsäuren und deren Harnstoffderivate sowie die entsprechenden Benzoesäurederivate. Sie zeigten keine Aktivität an P-gp und sind damit selektive Modulatoren von MRP1. Die besten Substanzen sind mit einem IC50-Wert unter 1 µmol/l an MRP1 hochpotent. Für diese Modulatorklasse konnte ein einfaches Pharmakophormodell erstellt werden. Im Calcein-AM-Assay für MRP2 wirkte dies Substanzklasse hingegen aktivierend und erst in hohen Konzentrationen inhibierend.<br /> Als dritte neue Klasse an Modulatoren für MRP1 und MRP2 erwiesen sich p-Aminobenzoesäure-Derivate. Sie inhibierten sowohl den MRP1 als auch MRP2 vermittelten Calcein-AM-Transport. Die aktivste Substanz war mit einem IC50-Wert von etwa 1 µmol/l an MRP1 und um die 20 µmol/l an MRP2 potenter als alle gängigen Standardsubstanzen. Die neu entwickelten und charakterisierten Verbindungen wurden mit bekannten Modulatoren aus der Literatur verglichen. Es zeigte sich, dass sie häufig äquipotent oder, insbesondere an MRP2, sogar besser wirksam waren als die in der Literatur beschriebenen.<br /> Da MRP1 und MRP2 dafür bekannt sind auch Glutathion und Glutathionkonjugate zu transportieren, wurden neue fluoreszenzbasierte Assays zur Quantifizierung des intrazellulären und des hinaus transportierten Glutathions entwickelt und etabliert. Die Bestimmung des intrazellulären Glutathions ergab mit entsprechenden Daten aus Veröffentlichungen vergleichbare Ergebnisse. Im Assay zur Bestimmung des hinaus transportierten Glutathions wurde exemplarisch aus jeder der neu entdeckten Modulatorklassen eine Verbindung ausgewählt und untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass keine der Substanzen mit Glutathion assoziiert transportiert wird.<br /> Neben den neuen Modulatoren wurde auch die für MRP2 diskutierte Cisplatinresistenz mittels Atom-Absorptions-Spektroskopie genauer untersucht. Es konnte demonstriert werden, dass der Resistenzfaktor von den MRP2 exprimierenden Zellen gegenüber Cisplatin mit der Differenz in der Platinakkumulation nahezu identisch ist. Die Resistenz war unter Einsatz eines MRP2-Inhibitors reversibel, wohingegen ein künstlich ausgelöster Glutathion-Mangelphänotyp keinen Einfluss auf die Cisplatinaufnahme zeigte. Ebenso konnte demonstriert werden, dass <br /> Cisplatin nicht mit Glutathion assoziiert aus den Zellen hinaus transportiert wird, sodass die in der Literatur diskutierte Rolle von Glutathion bei der Detoxifikation von Cisplatin über MRP2 widerlegt werden konnte.<br /> In einem letzten Schritt wurden Kombinations-Experimente für MRP2 jeweils mit einem Aktivator und einem Inhibitor durchgeführt. Es wurde eine Dose-Ratio-Auswertung, Untersuchungen zur Anzahl von interagierenden Bindungsstellen und eine enzymkinetische Auswertung vorgenommen. Es konnte unter anderem gezeigt werden, dass zur Inhibition des MRP2 vermittelten Calcein-AM-Transportes zwei Bindungsstellen blockiert werden müssen, während zur Aktivierung des Transportes die Bindung an einer Bindungsstelle ausreicht. Bei der enzymkinetischen Auswertung konnten über die durch den Inhibitor und den Aktivator ausgelöste Änderung der Transportgeschwindigkeit, Rückschlüsse auf deren Interaktion gezogen werden. So konnten die zwei bekannten Bindungsstellen für β-Estradiol-17-β-D-Glukuronid und Indometacin an MRP2 unterschieden werden. Des Weiteren zeigte sich, dass sowohl die ortho-Thioureidocarbonsäuren als auch die Benzimidazolderivate mit β-Estradiol-17-β-D-Glukuronid um die Steroidbindungsstelle konkurrieren. Das p-Aminobenzoesäure-Derivat Gü 83 scheint weder an die Steroidbindungsstelle noch an die Bindungsstelle des Indometacins zu binden, was auf eine mögliche dritte Bindungsstelle schließen lässt.<br /> Die in dieser Arbeit entwickelten und eingesetzten Methoden können zur Charakterisierung der MRP1 und MRP2 induzierten Multidrug-Resistenz herangezogen werden und somit Einblicke in die Funktion dieser Resistenzproteine geben. Dissertation Bonn 2009