Expression of genes related to energy balance in adipose tissue of dairy cattle

Abstract

The aim of this thesis was to study the effect of propionate (C3) and β-hydroxybutyrate (BHB) on the mRNA abundance of reference genes (RGs) and of the genes of interest (GOI) related to energy balance, by short term incubation (4 h) in bovine AT explants <em>in vitro</em>. Herein, we focused on three aspects: First, the differential effect of C3 and BHB on RGs and their use in gene expression normalization to improve the reliability of quantitative real-time PCR (qPCR) data. For this purpose, geNorm^TM and Normfinder© programs were used to identify the RGs with highest stability. The geometric mean of the RGs identified by geNorm^TM as being most stable in C3 and BHB treatment was used for accurate normalization. Second, to explore the effects of C3 and BHB on the mRNA abundance of energy balance related genes in subcutaneous (SC) and retroperitoneal (RP) adipose tissue (AT) explants. We demonstrated that <em>in vitro</em> stimulation of bovine SC and RP AT explants with different concentrations of C3 or BHB in short-term exerts differentiated effects on the mRNA abundance of the analyzed energy balance related genes adiponectin, adiponectin Receptor 1 (AdipoR1), AdipoR2, peroxisome proliferation-activated receptor gamma 2 (PPARγ2), insulin receptor substrate 1 (IRS-1), CCAAT/<em>enhancer binding protein</em> α (C/EBPα), facilitated glucose transporter 4 (GLUT4), interleukin 6 (IL-6) and sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP1). Adiponectin receptor 1 and AdipoR2 mRNA were less affected by BHB than by C3 in the bovine explant model, indicating that the bovine adiponectin system might be more sensitive to C3 than to BHB.<strong> </strong>The mRNA abundance of PPARγ2, a key regulator of adipogenesis, was increased by C3 in SC AT explants, while C3 suppressed mRNA abundance of IRS-1 in RP AT. The insulin-induced alterations were limited to the mRNAs of free fatty acid receptor 3 (FFAR3) and IL-6 in SC and RP AT, respectively, for which a trend (<em>P</em>≤0.15) for increased abundances was recorded. Third, we established a bovine primary preadipocyte culture for characterizing the mRNA expression of the genes encoding C/EBPα, FFAR2, FFAR3, fatty acid binding protein (FABP4) and PPARγ2 during differentiation. In addition to increased mRNA abundance of the GOI during differentiation, we demonstrated the presence of FFAR2 and FFAR3 mRNA not only in both AT depots but also in differentiating preadipocytes isolated from bovine SC AT.

<strong>Expression von Energie-Bilanz-assoziierten Genen </strong><strong>im Fettgewebe von Milchkühen : Einfluss von SCFA auf die mRNA-Expression, quantifiziert mittels qPCR sowie Relevanz der Auswahl geeigneter Referenzgene</strong><br /> Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Propionat (C3) und ß-Hydroxybutyrat (BHB) auf die mRNA-Menge von verschiedenen Referenzgenen (RGs) und von Zielgenen (GOI), die mit der Energiehomöostase in Zusammenhang stehen, in Kurzzeitstimulationsversuchen (4 h) an <em>Explantaten aus zwei unterschiedlichen Fettdepots (subkutan (SC) und retroperitoneal (RP)) von Milchkühen </em><em>in vitro</em> zu untersuchen. Hierbei haben wir uns auf drei Aspekte konzentriert: (1) die differenzielle Wirkung von C3 und BHB auf RGs sowie deren Verwendung in der Normalisierung zur Verbesserung der Zuverlässigkeit von <em>Real</em><em>-</em><em>Time</em><em>-</em><em>quantitative</em><em>-</em><em>PCR-</em> (qPCR-) daten. Zu diesem Zweck wurden das geNorm^TM- und das Normfinder©- Programm verwendet, um die stabilsten RGs zu identifizieren. Die geometrischen Mittelwerte der stabilsten RGs, gekennzeichnet durch geNorm^TM als die stabilsten RGs bei C3- und BHB-Behandlung, wurden für die weitere Normalisierung verwendet. (2) Die Wirkung von C3 und BHB auf die mRNA-Abundanz der Gene, die mit der Energiehomöostase in Zusammenhang stehen, in SC und in RP Fettgewebse<em>xplantaten zu </em>untersuchen. Wir haben dabei gezeigt, dass die <em>in vitro</em> Stimulation von bovinem SC und RP Fettgewebe mit verschiedenen Konzentrationen von C3 oder BHB nach kurzer Zeit (4 h) differenzierte Auswirkungen auf die mRNA-Abundanz von Adiponectin, Adiponectin Rezeptor 1 (AdipoR1), AdipoR2, Peroxisomen-Proliferator-aktiviertem Rezeptor gamma 2 (PPARγ2), Insulinrezeptor-Substrat 1 (IRS-1), CCAAT/enhancer-binding-Proteine α (C/EBPα), Glucosetransporter 4 (GLUT4), Interleukin-6 (IL-6) und Sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP1) hat. Die mRNA von AdipoR1/R2 wurde im bovinen <em>Explantat-</em>Modell durch BHB weniger beeinflusst als durch C3; dies deutet darauf hin, dass das Adiponectin-System gegenüber C3 sensitiver sein könnte als gegenüber BHB. Die mRNA von PPARγ2, einem der Hauptregulatoren der Adipogenese, wurde von C3 in SC Fettgewebe erhöht, während C3 die mRNA von IRS-1 im RP Fettgewebe reduzierte. Die Insulin-induzierten Veränderungen waren auf die mRNAs des Freie Fettsäuren Rezeptors 3 (FFAR3) und von IL-6 in SC und RP Fettgewebe beschränkt, und zeigten bei beiden Genen einen Trend (<em>P</em>≤0,15) zur Erhöhung der mRNA-Menge. (3) Etablierung eines Zellkultursystems für primäre, bovine Präadipozyten zur Charakterisierung der mRNA-Expression der Gene von C/EBPα, FFAR2, FFAR3, <em>Fettsäure</em><em>-</em>bindendem<em>Protein</em> 4 (FABP4) und PPARγ2 während der Differenzierung. Neben dem zeitlichen Anstieg der einzelnen mRNAs haben wir als Erste den Nachweis von FFAR2 und FFAR3 mRNA in beiden Depots des Fettgewebes erbracht.