Gewebsspezifische Expression von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen und Signalübertragung an das Mikrotubuli- Zytoskelett in <em>Arabidopsis thaliana</em>

Abstract

In dieser Arbeit sind drei MAPK aus A. thaliana näher charakterisiert wurden. Wie bereits bekannt ist, sind MPK3, MPK4 und MPK6 an vielen abiotischen und biotischen, sowie entwicklungsspezifischen Signalwegen beteiligt. Durch Promotor GUS-Konstrukte dieser MAPK wurde die gewebespezifische Expression vor allem in der Wurzel analysiert. Alle drei MAPK sind in distinkten Geweben der Wurzel aktiv und können in ihrer Promotoraktivität und Gewebespezifität durch Applikation von abiotischen Stressen beeinflusst werden. Der Zusammenhang zwischen MAPK Signalgebung und dem Zytoskelett in A. thaliana wurde durch die zellbiologische Analyse von ausgewählten MAPK Mutanten studiert. Dafür wurden zwei MAPK/MAP3K Mutanten morphologisch und zellbiologisch näher charakterisiert. Dabei handelt es sich zum einen um die mpk4 Mutanten Linie. Sie ist die einzig bekannte Einzelmutante einer MAPK, die auffällt durch einen starken Phänotyp bedingt durch Wachstumsdefekte. Als MAP3K Mutante wurde die anp2xanp3 Mutante gewählt. Diese Mutante ist als zytokinetische Mutante beschrieben, weist jedoch noch zusätzlich morphologische Abnormalitäten der epidermalen Zellen auf. Vergleicht man die morphologischen Merkmale beider Mutanten, so ist es offensichtlich, dass sie einem bestimmten Grad ähnliche Defekte aufweisen, jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Beide Mutanten Arabidopsis Linien zeigen ein verlangsamtes Wurzelwachstum, gekennzeichnet durch Zwergwuchs. Beide Mutanten sind gekennzeichnet durch abnormale Wurzelformen, die zum einen bedingt sind durch gestörtes Wachstumsmuster der epidermalen Zellen, zum anderen durch extrem abnormale Wurzelhaarformen wie mehrfach verzweigte und geschwollene Wurzelhaare. Zusätzlich zur Wurzel fielen auch in anderen vegetativen Geweben ähnliche Abnormalitäten auf, einschließlich abnormale epidermale Zellen des Hypokotyls und Stomata und Epidermiszellen der Kotyledonen. Die morphologischen Änderungen wiesen auf mögliche Fehler im kortikalen Microtubuli (MT) Netzwerk hin. Per Immunmarkierung konnten bei beiden Mutanten gezeigt werden, dass die kortikalen MT extrem gebündelt vorliegen. Dies konnte in vivo durch neu generierte GFP-MBDanp2xanp3 und GFP-MBDmpk4 Linien noch unabhängig bestätigt werden. Als Zielprotein der MAPK Signalkaskade konnte MAP65-1 nachgewiesen werden. Ein MT-bündelndes Protein, welches in den Mutanten akkumuliert an den kortikalen MT nachzuweisen ist. Des Weiteren wurden zytokinetische Defekte in beiden Mutanten offensichtlich, die sich durch mehrkernige Zellen, schief orientierte Spindeln und Phragmoplasten und Zellwandreste äußerten. Im Detail ließen sich die mehrkernigen Zellen und Zellwandreste auf Phragmoplasten zurückführen, die sich durch fehlerhafte Expansion kennzeichneten. Dopppelmarkierungen mit MPK4 oder MPK6 und MT, sowie MAP65-1 und MT konnten eindeutig beide MAPK und MAP65-1 an zytokinetischen Präprophase Bändern (PPB) und Phragmoplasten lokalisieren. Dies deutet auf eine mögliche Beteiligung der MAPK an der Regulierung von MAP65-1 während der Mitose und Zytokinese hin. Zusätzlich zum MT-Zytoskelett wurde noch das Aktin-Zytoskelett visualisiert, welches in beiden Mutanten ebenfalls verändert vorliegt.<br /> Um in vivo die Beteiligung von MAPK an intrazellulären Prozessen näher zu untersuchen, wurden GFP-Konstrukte aller drei MAPK erstellt und in Pflanzenzellen exprimiert. Die Fusionsproteine sind nicht nur wie vermutet im Zytoplasma und im Nukleus lokalisiert, sondern befinden sich zusätzlich im Zytoplasma an vesikelähnlichen Strukturen. Für 35S::GFP:MPK6 konnten diese Vesikel als trans-Golgi network (TGN) Vesikel identifiziert werden.