Prozessentwicklung zur Produktion von 2-Keto-L-Gulonsäure, einer Vitamin C-Vorstufe

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein biotechnologisches Verfahren entwickelt, mit dem sich kontinuierlich 2-Keto-L-Gulonsäure (2-KLG) aus Glucose produzieren lässt. 2-KLG ist eine Vorstufe von Vitamin C. 2-KLG wurde aus D-Glucose in einer zweistufigen Reaktion hergestellt: Glucose wurde zunächst zur 2,5-Diketo-D-Gluconsäure (2,5-DKG) oxidiert mit <i>Gluconobacter oxydans</i>; 2,5-DKG wurde dann mit dem Enzym 2,5-Diketogluconatreduktase zu 2-KLG reduziert. Beide Reaktionen wurden in verschiedenen Reaktoren durchgeführt, 2,5-DKG wurde ohne weitere Aufarbeitung in den zweiten Reaktor gepumpt. Ruhende Zellen von <i>Gluconobacter oxydans</i> konnten erfolgreich im Satzverfahren und im kontinuierlich betriebenen Rührkesselreaktor (CSTR) eingesetzt werden. In beiden Fällen ist eine ausreichende Sauerstoffversorgung entscheidend. In einem speziell entwickelten Satzreaktor konnte die Aktivität der Zellen im Vergleich zum Schüttelkolben durch Begasung mit reinem Sauerstoff verdreifacht werden. So wurden Ausbeuten von bis zu 97% erreicht. Im CSTR konnten Ausbeuten von etwa 80% über mehrere Tage gehalten werden, die Raum-Zeit-Ausbeute betrug dann 92 g*L^-1*d^-1. Das Enzym 2,5-Diketogluconatreduktase wurde aus rekombinanten <i>E. coli</i> Zellen isoliert mit guten Ausbeuten von 0,31 mg>sub>Protein/g_Zellen. Das Enzym akzeptiert NADH als Cofaktor, aber bevorzugt NADPH (KM,>sub>NADH = 500 * KM,>sub>NADPH). Zur Cofaktorregenerierung wurde eine Alkoholdehydrogenase aus <i>Lactobacillus brevis</i> verwendet. Die beiden Enzyme wurden erfolgreich im Enzymmembranreaktor eingesetzt, um 2-KLG aus 2,5-DKG mit Ausbeuten von bis zu 100% zu produzieren. Die höchste Raum-Zeit-Ausbeute war 329 g*L^-1*d^-1 mit Produktausbeuten von 81%. Nach der Kopplung beider Reaktorsysteme wurde 2-KLG kontinuierlich aus D-Glucose produziert, mit Ausbeuten von 68% und Raum-Zeit-Ausbeuten von 41,5 g*L^-1*d^-1. Der Prozess lief über 8 Tage stabil.

<strong>Process development for the production of 2-keto-L-gulonic acid, a precursor of vitamin C</strong><br /> In this study a process for the continuous production of 2-keto-L-gulonic acid was developed. This compound is a precursor of vitamin C and therefore of great industrial interest. 2-Keto-L-gulonic acid (2-KLG) was produced from D-glucose in a two-step reaction: Glucose was first oxidized to 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) with cells of <i>Gluconobacter oxydans</i>, 2,5-DKG was then reduced to 2-KLG with the enzyme 2,5-diketo-D-gluconate reductase. Both reactions were carried out in separate reactors; 2,5-DKG was transferred into the second reactor without any further processing or purification. Resting cells of <i>Gluconobacter oxydans</i> could successfully be applied in batch and continuously stirred tank reactors (CSTR) for the production of 2,5-DKG. In both cases, sufficient supply of oxygen is crucial; in a specially constructed batch reactor the activity of the cells was increased threefold compared to the activity in shaking flasks. Thus, yields of up to 97% were achieved in the batch reactor. In a CSTR, yields of about 80% could be kept for several days, in that case the space-time-yield was 92 g*L^-1*d^-1. The enzyme 2,5-diketo-D-gluconate reductase (2,5-DKGR) was isolated and purified from recombinant <i>E. coli</i> cells in good yields of 0.31 mg>sub>Protein/g_cells. In kinetic investigations it accepted NADH as a cofactor but showed a much higher preference for NADPH (KM,>sub>NADH = 500 * KM,>sub>NADPH). Cofactor regeneration worked best with the alcohol dehydrogenase from <i>Lactobacillus brevis</i>. The two enzymes were successfully applied in an enzyme membrane reactor to produce 2-KLG from 2,5-DKG with yields of up to 100%. The highest space-time-yield was 329 g*L^-1*d^-1 with product yields of 81%. After coupling the two reactor systems, 2-KLG could be produced continuously from D-glucose with yields of 68% and space-time-yields of 41.5 g*L^-1*d^-1 for more than eight days. This study showed that the yields in this two-step reaction can be improved if the two steps are carried out in separate reactors. This way, the best reaction conditions for both oxidation and reduction can be adjusted.