Signalwegsaktivierung an muskarinischen M₂-Rezeptoren

Abstract

Neben der orthosterischen Bindungsstelle für den endogenen Liganden Acetylcholin und andere konventionelle Agonisten und Antagonisten besitzen muskarinische Acetylcholinrezeptoren eine zweite, allosterische Bindungsstelle. Vorangegangene Untersuchungen führten zu einer umfangreichen Charakterisierung dieses Haftareals und zur Identifizierung von spezifischen allosterischen Liganden, die orthosterische Ligandeigenschaften modulieren können. Bisher ist die physiologische Funktion der allosterischen Bindungsstelle jedoch unbekannt. Hauptziel dieser Arbeit war durch verschiedene methodische Herangehensweisen zu untersuchen, ob bzw. welchen Einfluss die allosterische Bindungsstelle auf die Signalwegsaktivierung muskarinischer M₂-Rezeptoren hat. Da die meisten allosterischen Modulatoren, zu denen auch die Alkan-Bisammonium-Verbindungen W84 und Naphmethonium gehören, die höchste Affinität zum M₂-Rezeptor aufweisen, stand dieser Subtyp im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. <br /> Als erster methodischer Ansatz wurde die Untersuchung des Einflusses allosterischer Epitope auf die orthosterische Aktivierung von M₂-Rezeptoren gewählt. Ziel war es, herauszufinden, wie die Eigenschaften eines orthosterischen Liganden am M₂-Rezeptor durch gezielte Mutagenese von Epitopen im Bereich der allosterischen Bindungsstelle beeinflusst werden. Von besonderem Interesse war die Untersuchung der Rezeptoraktivierung durch den endogenen Agonisten Acetylcholin, sodass [³⁵S]GTPγS-Bindungsexperimente ein geeignetes Versuchssystem waren. Die Untersuchungen wurden an Membransuspensionen aus CHO-Zellen durchgeführt, in die zuvor, mittels stabiler Transfektion, die M₂-Rezeptor-cDNA vom Wildtyp bzw. die im Bereich der allosterischen Bindungsstelle punktmutierte Rezeptor-cDNA eingebracht worden waren. <br /> Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des muskarinischen M₂-Rezeptors durch orthosterische Liganden von allosterischen Rezeptor-Epitopen beeinflussbar ist. Das konservierte Epitop M₂⁴²²Tryptophan (Trp 7.35), das im Kernbereich der allosterischen Bindungsstelle liegt, leistete einen erheblichen Beitrag zur Wirksamkeit des endogenen Liganden Acetylcholin und von anderen Vollagonisten. Außerdem wurde durch die Punktmutation M₂⁴²²Trp→Ala die intrinsische Aktivität von Pilocarpin entscheidend herabgesetzt. Darüber hinaus wurde M₂⁴²²Trp als wichtiges Epitop für die konstitutive Rezeptoraktivität identifiziert und hatte einen hohen Anteil am spontanen, Agonist-unabhängigen Übergang in die aktive Rezeptorkonformation. Das Epitop M₂⁴²²Tryptophan zeigte ein bifunktionales Verhalten: Mit diesen Befunden konnte ein Hinweis erbracht werden, dass durch die Agonist-induzierte Veränderung der Rezeptorkonformation die Aminosäure der allosterischen Bindungsstelle entzogen wird und für die orthosterische Rezeptoraktivierung zur Verfügung steht. <br /> Als zweite methodische Herangehensweise wurden dualsterische Hybridagonisten, die eine orthosterische und eine allosterische Strukturkomponente vereinigen, als pharmakologische Werkzeuge verwendet. Die räumliche Nähe der im Bereich der extrazellulären Schleifen angesiedelten, allosterischen Bindungsstelle zum orthosterischen Haftareal, das sich im oberen Drittel der transmembranären Domänen befindet, hatte zur Entwicklung dieser Hybridliganden geführt. Die untersuchten Substanzen bestanden aus einem orthosterischen Agonisten (Derivat von Oxotremorin M) und einem Strukturelement eines allosterischen Antagonisten vom Typ der Alkan-Bisammonium-Verbindungen. Die kovalente Verbindung erfolgte über eine Alkan-Zwischenkette. Durch die Hybridbildung sollte eine gleichzeitige Interaktion mit beiden Bindungsstellen ermöglicht und so dem orthosterischen Liganden zu einer besseren Haftung am Rezeptor und einer Subtypselektivität verholfen werden. Es wurde untersucht, welche Auswirkung die zusätzliche Ausnutzung der allosterischen Bindungsstelle hat, hinsichtlich der Rezeptoraktivierung auf der ersten Stufe, d.h. auf G-Protein-Ebene sowie auf Ganzzell-Ebene. Durch Ganzzell-Messungen zur dynamischen Massenumverteilung mit Hilfe des optischen Biosensors Epic konnte festgestellt werden, dass durch die dualsterischen Rezeptoraktivatoren Hybrid 1 und Hybrid 2 eine selektive Aktivierung des Signaltransduktionsweges über Adenylylzyklase inhibierende Gi-Proteine erfolgte. Die Aktivierung von Adenylylzyklase stimulierenden Gs-Proteinen, die für orthosterische Agonisten nachgewiesen wurde, konnte durch Einführung des allosterischen Molekülteils verhindert werden.<br /> Ferner zeigten Hybrid 1 und Hybrid 2 keine vollständige Rezeptoraktivierung, im Gegensatz zum orthosterischen Mutteragonisten Iperoxo. Vor allem beim Vorliegen hoher cAMP-Spiegel und einer maximal stimulierten Adenylylzyklase ergab sich ein nur partieller inhibitorischer Effekt über Gi-Proteine. Durch Verlängerung der im Hybrid 1 vorliegenden C6-Zwischenkette um eine bzw. zwei Methylengruppen konnte eine volle intrinsische Aktivität wiederhergestellt werden, bei Konservierung der selektiven Signalwegsaktivierung des Gi-Signaltransduktionsweges in Messungen der zellulären dynamischen Massenumverteilung.<br /> Die gleichzeitige Besetzung beider Bindungsstellen des Rezeptors durch dualsterische Liganden hatte Auswirkungen auf die Rezeptorkonformation und konnte durch zusätzliche Ausnutzung des allosterischen Haftareals ein gezieltes Ansprechen von bestimmten Signalwegen ermöglichen. Diese Befunde liefern somit einen ersten Anhaltspunkt dafür, dass die allosterische Bindungsstelle des M₂-Rezeptors einen Einfluss auf die Spezifität der Signalwegsaktivierung haben kann.