Jacobs, Anna: Expression, Aufreinigung und funktionelle Untersuchungen der ABC-Transporter ABCB1 und ABCG2. - Bonn, 2010. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-22268
@phdthesis{handle:20.500.11811/4628,
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title = {Expression, Aufreinigung und funktionelle Untersuchungen der ABC-Transporter ABCB1 und ABCG2},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2010,
month = jul,

note = {Die ABC-Transporter ABCB1 und ABCG2 beeinflussen aufgrund ihrer ubiquitären Expression in physiologischen Barrieren und ihrer breiten Substraterkennung die Pharmakokinetik vieler unterschiedlicher Arzneistoffe. Außerdem sind sie in die klassische Form der Multidrug Resistenz von Tumorzellen involviert. Im Fokus der aktuellen Forschung stehen vor allem die Mechanismen des Substrattransportes sowie der Polyspezifität. Durch Untersuchungen in diesen Bereichen können grundlegende Erkenntnisse über ABCB1 und ABCG2 gewonnen werden, welche zukünftig dazu beitragen, beispielsweise Arzneistoffinteraktionen zu vermeiden oder die Weiterentwicklung von Wirkstoffkandidaten effektiver zu gestalten.
Untersuchungen an den aufgereinigten Proteinen sind neben funktionellen Assays mit lebenden Zellen wichtige Werkzeuge zur Charakterisierung von ABC-Transportern. Um derartige Untersuchungen durchzuführen, werden große Mengen an reinem und funktionellem Protein benötigt, die vor allem aus heterologen Expressionssystemen gewonnen werden können. Die Evaluierung und Etablierung neuer Expressionssysteme für ABCG2 sowie die Optimierung eines vorhandenen Systems für ABCB1 standen ebenso im Vordergrund dieser Arbeit wie die Etablierung und Verbesserung von Methoden zur Aufreinigung beider Transportproteine.
Ein bereits vorhandenes heterologes Expressionssystem für ABCB1 im Saccharomyces cerevisiae Stamm BJ5457-ABCB1 wurde so optimiert, dass es zukünftig für die routinemäßige Anwendung eingesetzt werden kann. Zur Steigerung der Expression des ABC-Transporters in diesem Hefestamm wurde der Einsatz von zwei verschiedenen Selektionsantibiotika (Valinomycin und Aureobasidin A) evaluiert. Insgesamt war Aureobasidin A deutlich besser geeignet als Valinomycin, um BJ5457-ABCB1 Klone mit hohem Expressionslevel zu selektieren.
Membranpräparationen dieser Klone wurden im Weiteren verwendet, um daraus ABCB1 aufzureinigen und in Proteoliposomen zu rekonstituieren. Um die Ausbeute an rekonstituiertem Protein zu erhöhen, wurde die Solubilisationseffizienz der beiden Detergenzien Taurodesoxycholat (TDOC) und Lysophosphatidylcholin (LPC) verglichen. Die Gesamtausbeute betrug bei Verwendung von LPC 20 %, wohingegen mit TDOC nur 4 % des solubilisierten ABCB1 isoliert wurden. Das auf diese Weise aufgereinigte Protein wurde für Untersuchungen mittels ATPase Assay eingesetzt, die sich mit dem Mechanismus der Aktivierung des Substrattransportes beschäftigten. Dabei wurden zwei Verbindungen verwendet, die in zellbasierten Testsystemen den Substrattransport durch ABCB1 stimulieren. Es konnte gezeigt werden, dass die ATP-Bindungsstellen am Mechanismus der Verstärkung des Substrat-Transportes nicht beteiligt sind.
Die für die Expression von ABCB1 in Hefen gewonnenen Erkenntnisse wurden auf ABCG2 übertragen. Hierbei wurde der Saccharomyces cerevisiae Stamm LPY11-ABCG2 als Expressionssystem etabliert. Das Protein lag als zwei Spezies mit sehr geringem Molekulargewichtsunterschied vor. Daneben wurden Untersuchungen durchgeführt, deren Ergebnisse darauf hinweisen, dass ABCG2 in den Hefezellen und auch nach Membranpräparation als Dimer und somit in seiner kleinsten funktionellen Einheit vorliegt. Auch die Techniken zur Proteinaufreinigung wurden für ABCG2 etabliert und optimiert. ABCG2 konnte mit Hilfe der Detergenzien Octylglucosid und Dodecylmaltosid erfolgreich aus Membranen des Hefestammes LPY11-ABCG2 solubilisiert werden. Im ATPase Assay zeigte sich eine durch Prazosin und weitere literaturbekannte Verbindungen stimulierte Zunahme der vanadat-sensitiven ATPase Aktivität. Damit konnte gezeigt werden, dass ABCG2 in seiner aktiven Konformation aus den Hefemembranen extrahiert wurde.
Alternativ zu Saccharomyces cerevisiae wurde die Verwendung von Insektenzellen als heterologes Expressionssystem für ABCG2 evaluiert. Die beiden zur Verfügung stehenden Zelllinien High Five (Hi5) und Sf9 wurden in Bezug auf Expressionslevel und Aktivität des exprimierten Proteins verglichen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen für die Expression in Hefen wurde das Protein in beiden Zelllinien als zwei Spezies mit sehr geringem Molekulargewichtsunterschied gebildet. Membranpräparationen aus beiden Zelllinien wiesen eine durch Prazosin stimulierbare vanadat-sensitive ATPase Aktivität auf. Im Vergleich zu Sf9 Zellen zeigten Hi5 Zellen eine höhere Expressionsrate und wurden aus diesem Grund für die weiteren Studien verwendet.
Für die Aufreinigung von ABCG2 aus Hi5 Membranpräparationen wurde nach einem Detergenzienscreening die zwitterionische Verbindung CHAPS ausgewählt. Dabei wurde deutlich, dass das Detergenz in der Lage war, selektiv die aktive Proteinspezies aus den Zellmembranen herauszulösen. ABCG2 konnte im Weiteren durch eine Cobalt-basierte Affinitätschromatographie in sehr guter Reinheit extrahiert werden. Im Vergleich zu Hefen wies die Insektenzellline Hi5 den Vorteil einer deutlich erhöhten Expression des Zielproteins auf, so dass geringere Mengen an Ausgangsmaterial für die Aufreinigung benötigt wurden. Aus Membranpräparationen dieser Zellen kann also nahezu reines Protein gewonnen werden.
Mit Hilfe von aufgereinigtem und in Proteoliposomen rekonstituiertem ABCG2 können zukünftig biophysikalische Studien durchgeführt werden, durch welche die offenen Fragestellungen zur genauen Struktur und zum Aufbau von ABCG2 beantwortet werden.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/4628}
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