Etablierung eines Systems zur reversiblen Geninduktion und Untersuchungen zur Funktion von Bmpr1a in ESZellen und <em>in vitro</em> generierten neuralen Vorläuferzellen

Abstract

Ortsspezifische Rekombinasen wie Cre und Flpe sind wichtige Werkzeuge zur gezielten Geninaktivierung oder –Überexpression. Die kombinierte Nutzung von Cre und Flpe ermöglicht eine unabhängige und/oder sequentielle Genregulation für die Aufklärung komplexer biologischer Fragestellungen. Diese dualen Rekombinase-strategien sind bislang wegen der vergleichsweise niedrigen Flpe-Effizienz nicht praktikabel. In dieser Arbeit wurden mit einer zellpermeablen Flpe-Rekombinase in murinen ES-Zellen bei unveränderter Zellvitalität Rekombinationseffizienzen von bis zu 45% erreicht. Wie mit dem FC (Flp-ON-Cre-OFF)-Vektor, einer strikt kontrollierbaren, reversibel induzierbaren Expressionskassette, gezeigt werden konnte, ist das Flpe-Transduktionssystem eine optimale Ergänzung für Anwendungen mit der zellpermeablen Cre-Rekombinase. <br /> Der bmpr1α wurde in vitro mit der zellpermeablen Cre-Rekombinase konditional inaktiviert. Unter Serum-freien Bedingungen ist die Pluripotenzerhaltung von ES-Zellen abhängig von exogenem Bmp4. Die bmpr1α-Deletion führte lediglich zu einer eingeschränkten Proliferation und Klonogenität sowie zu einer erniedrigten Expression der Pluripotenz-assoziierten Faktoren nanog und id1. Die Bmp-vermittelte Inhibition der neuralen Differenzierung bei Serum-Abwesenheit war in bmpr1α-defizienten ES-Zellen vermutlich durch die kaum nachweisbare Smad-Aktivierung aufgehoben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Bmpr1a in ES-Zellen für ihr vollständiges Differenzierungspotential und die uneingeschränkte Fähigkeit zur Selbsterneuerung benötigt wird, gleichzeitig jedoch Kompensations-mechanismen existieren, die dem bmpr1α-Verlust entgegenwirken. In weiteren Analysen wurde gezeigt, dass bmpr1a mutante ES-Zellen mit alk2 einen weiteren Typ I Bmp-Rezeptor exprimieren, über eine verstärkte Expression des Proliferations-assoziierten β-Catenin-Proteins verfügen und nur bei erhöhter bmp2-Expression fortschreitend proliferieren. <br /> Während der glialen Differenzierung fördern Bmps die Astrogenese und inhibieren die Oligodendrogenese. Nach der bmpr1a Inaktivierung in neuralen Voräufern blieb das astrozytäre und oligodendrogliale Differenzierungspotential unverändert. Möglicherweise war die lediglich verminderte Bmp-abhängige Fähigkeit zur Smad-Aktivierung durch die Expression der Bmp Typ I Rezeptoren bmpr1b und alk2 verursacht worden.