Biochemische Untersuchungen zum DsrC Protein und zum DsrEFH Heterohexamer von <em>Allochromatium vinosum</em>

Abstract

Für das cytoplasmatische DsrC Protein, des Schwefel oxidierenden Bakteriums <i>Allochromatium vinosum</i> wurden, mit Hilfe der zielgerichteten Mutagenese, drei rekombinanteSubstitutionsmutanten generiert. Die beiden Einfachmutanten <i>dsrC C100</i> und <i>dsrC C111</i> sowie die Doppelmutante <i>dsrC C100/C111</i> wurden in den pET15b Vektor einkloniert und exprimiert. <br /> In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass infolge der Austausche der Cysteine innerhalb der drei mutierten Proteine DsrC C100S, DsrC C111S und DsrC C100S/C111S, die Expression und Aufreinigung nicht beeinträchtigt wurden. Gemeinsam mit den Auswertungen der NMR spektroskopischen Untersuchungen (Cort et al., 2008), war das ein Hinweis dafür, dass die mutierten Proteine korrekt gefaltet wurden und führten zu der Schlussfolgerung, dass die ausgebildeten Disulfidbrücken des rekombinanten DsrC Proteins für die Faltung nicht essentiell sind. <br /> Die Substitution der beiden Cysteine Cys100 und Cys111 bedingte das Fehlen jeglicher Disulfidbrücken. Das Cystein 111 konnte als ursächlich für die intermolekulare Disulfidbrückenbildung und der damit einhergehenden Homodimerbildung identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass diese Cys111-Cys111 Dimere, die die thermodynamisch weniger stabile Form darstellen, schnell unter nicht reduzierenden Bedingungen bei der Exposition an Luftsauerstoff gebildet werden. Diese thermodynamisch weniger stabile Form geht bei längerer Inkubation oder durch Verwendung von H2O2 in eine thermodynamisch stabile Form über, indem die freiliegende SH-Gruppe eines Cys100 ein Cys111 innerhalb eines Cys111-Cys111 Dimers austauscht und somit eine intramolekulare Disulfidbrücke, der Form Cys100-Cys111, bildet. <br /> Mit Hilfe der mutierten DsrC Proteine konnte geklärt werden, dass für eine mit dem DsrEFH Proteinkomplex stattfindende Interaktion, das Cystein 111 essentiell ist. Bei dieser Interaktion findet eine Konformationsänderung des Heterohexamers DsrEFH statt. <br /> Die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Reduktionsmittels TCEP zeigte, dass eine definierte TCEP Endkonzentration die Interaktion zwischen dem rekombinanten DsrC und dem rekombinanten Heterohexamer DsrEFH entscheidend fördert. Abschließend wurde postuliert, dass die Proteine DsrAB, DsrC und der DsrEFH Proteinkomplex an einem Schwefeltransfer beteiligt sind wie es analog zu den verwandten Proteinen aus E. coli diskutiert wurde.