Synthese von Nucleotid-Derivaten mit Phosphorsäureamid-Verknüpfung

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren zum empfindlichen Nachweis von Nucleotiden mittels Fluoreszenzmarkierung und anschließender kapillarelektrophoretischer Trennung mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion entwickelt. Zu diesem Zweck musste eine Derivatisierungsstrategie gefunden werden, die eine reproduzierbare und möglichst effiziente Kupplung von Nucleotid-Mono, -Di- und Triphosphaten mit geeigneten Fluoreszenzmarkern ermöglicht. Es wurde gezeigt, dass die Komplexbildung des vicinalen Diols der Ribose in der 2’,3’-Position mit fluoreszierenden Boronsäurederivaten aufgrund der Instabilität des Komplexes im Wässrigen nicht für die kapillarelektrophoretische Auftrennung geeignet ist. Demgegenüber eröffnet die Kupplung eines Fluoreszenzmarkers, der über eine primäre aliphatische Aminogruppe als Ankergruppe verfügt, die selektive Derivatisierung der terminalen Phosphatgruppe von Nucleotiden nach Carbodiimid-Aktivierung. Anhand eines Modells zur Umsetzung von AMP, GMP und ATP mit Dansylaminoethylamin (1), welches mit einem He-Cd-Laser angeregt werden kann, wurden Reaktionsparameter für die Derivatisierung der Nucleotide entwickelt, die eine einfache und effiziente Umsetzung unter milden Bedingungen mit einem vertretbaren finanziellen Aufwand ermöglichen sollten. <br /> Als unabdingbare Vorraussetzung stellte sich heraus, dass der Fluoreszenzmarker wie auch der zur Aufrechterhaltung des geeigneten pH-Wertes einzusetzende Puffer frei von Carbodiimid-aktivierbaren funktionellen Gruppen wie Carbonsäuren oder Phosphatgruppen sein muss. Die mit diesem Modell gefundenen Reaktionsbedingungen konnten zur Fluoreszenzmarkierung von Nucleotiden in wässrigem Medium eingesetzt werden. <br /> Durch Synthese eines neuen Fluorescein-Derivatisierungsreagenzes (8) und der Verwendung eines Argon-Lasers zur Anregung, konnte die Derivatisierungsmethode weiter optimiert und eine bessere Empfindlichkeit erreicht werden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in der Entwicklung einer kapillarelektrophoretischen Methode zur Trennung der Fluoreszenz-markierten Nucleotide. Dabei erwies sich die Trennung mittels micellarer elektrokinetischer Chromatographie und die Verwendung eines lipophilen Fluorophors, einem BODIPY-Derivat (9), als geeignet, wobei aufgrund der starken lipophilen Wechselwirkungen des Fluoreszenzmarkers ein hinreichend großes micellares Fenster gewährleistet und eine Überlagerung der Nucleotid-Signale durch Marker-Überschuß vermieden werden konnte. Dadurch konnte die Derivatsierungslösung direkt, ohne weitere Aufreinigung, vermessen werden. Eine weitere Erhöhung der Empfindlichkeit erreichte man durch die Verwendung neutraler, Polyacrylamid-beschichteter Kapillaren. Mit dieser Methode konnte das Detektionslimit der Nucleotide auf bis zu 1 nM gesenkt werden. <br /> Die Phosphoramid-Verknüpfung stellte des Weiteren eine Möglichkeit zur Synthese neuer P2Y-Rezeptorliganden dar. Ausgehend von ATP oder UTP konnte eine einfache Methode entwickelt werden, um Nucleosidtriphosphorsäureester-γ-amide zu synthetisieren. Die terminale Phosphatgruppe der Nucleotide wurde durch N-(Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimid-HCl (EDC) aktiviert und die Aminkomponente wurde direkt zugegeben. Die Eintopfsynthese wurde in 1-Methylimidazol-Puffer bei einem pH-Wert von 8,5 durchgeführt. Die bei der Umsetzung von UTP mit aromatischen Aminen auftretende N-Acylharnstoffbildung konnte durch die Zugabe von Hydroxybenzotriazol (HOBt) unterdrückt werden. <br /> Des Weiteren gelang die Synthese von Adenosintetraphosphat aus ATP durch die Umsetzung mit Diphenylphosphorchloridat und anschließender Reaktion mit Dihydrogenphosphat (vorliegend als Tributylammoniumphosphat) im Wasserfreien.