Potential of fluorescence techniques with special reference to fluorescence lifetime determination for sensing and differentiating biotic and abiotic stresses in <em>Triticum aestivum L.</em>

Abstract

The key objective of the present thesis was to early assess physiological modifications of wheat plants due to biotic and abiotic stresses by means of non-destructive fluorescence measurement techniques. <br /> Experiments at leaf level were conducted under laboratory conditions, whereupon two economical important biotrophic fungi in wheat production, Puccinia triticina and Blumeria graminis, as well as nitrogen deficiency as the most significant factor in terms of nutrient management, were selected for representative studies. <br /> Experiments with the PAM-imaging system showed that the quantum yield of non-regulated energy dissipation in PSII (Y(NO)) is the most promising parameter for screening wheat plants for leaf rust resistance. Measurements revealed a stronger pathogen-triggered increase of the Y(NO) values in the susceptible than in the resistant cultivar. Thereby, the most appropriate time for a reliable differentiation between was two days after inoculation. Preliminary experiments with densities of up to 20 000 spores per ml in case of fast fluorescence kinetic parameters, and up to 100 000 spores per ml in case of slow kinetic parameters, revealed that changes in the fluorescence signals were not related to physical masking. <br /> The assessment of fluorescence lifetime and UV-induced spectra were adopted for the detection of leaf rust (Puccinia triticina) in three resistant in comparison to four susceptible cultivars. A combination of spectral and lifetime characteristics revealed pre-symptomatic alterations of fluorescence indicating changes in the content of chlorophyll and secondary metabolites. The determination of the B/G amplitude ratio seemed to be the most appropriate parameter for early detection of fungal infection. Discrimination between resistant and susceptible cultivars to the leaf rust pathogen might be feasible by monitoring the amplitude ratio of B/R fluorescence at three days after inoculation. In addition, mean lifetime at 440, 500 and 530 nm should be considered; these parameters revealed a more pronounced difference between control and inoculated leaves in the resistant cultivars. <br /> UV-induced spectral signature as well as mean fluorescence lifetimes are suitable approaches for sensing powdery mildew (Blumeria graminis) as early as one day after inoculation. The decreased amplitude ratio B/G as well as the increased G/R and G/FR half-bandwidth ratios in inoculated as compared to control leaves, were appropriate parameters to detect fungal development. In addition, the increased mean lifetime in inoculated leaves in the wavelength range of 500-620 nm may enable a distinction between healthy and diseased leaves. Additional experiments revealed an increased mean lifetime of the green fluorescence as early as ten to twelve hours after the first host-pathogen interaction.<br /> Fluorescence intensity measured between 370 and 800 nm provided to be a useful tool to address the challenge of discrimination between nitrogen deficiency and fungal diseases. Precisely, the amplitude ratio R/FR was suited for early detection, and gives a basis for discrimination between N-full-supply, N-deficiency, N-full-supply + pathogen and N-deficiency + pathogen. In addition, the blue-green fluorescence yielded important information targeting a possible discrimination between the evaluated multiple stress factors. Besides, several more fluorescence amplitude ratios and half-bandwidth ratios for leaf rust as well as half-bandwidth ratios for powdery mildew were found to be applicable for early detection of both leaf rust and powdery mildew infection, irrespective of the nitrogen status of the plants.

<strong>Potenzial von Fluoreszenztechniken unter besonderer Berücksichtigung der Fluoreszenzlebenszeit-Bestimmung zur Erfassung und Differenzierung biotischen und abiotischen Stresses in <em>Triticum aestivum L</em>.</strong><br /> Zielsetzung dieser Arbeit war es, mittels Fluoreszenz-Messtechniken am Beispiel von Weizenpflanzen die durch biotischen und abiotischen Stresss induzierten physiologischen Veränderungen zu ermitteln. <br /> Die Versuche wurden unter Laborbedingungen auf Blattebene durchgeführt, wobei zum einen zwei ökonomisch bedeutende biotrophe, pilzliche Erreger des Weizenanbaus, Puccina triticina und Blumeria graminis, sowie zum anderen Stickstoffmangel als bedeutendster Vertreter des Nährstoffmanagements, für repräsentative Studien ausgewählt wurden. <br /> Die Versuche unter Einsatz des PAM-Imaging Systems ergaben, dass die Quantenausbeute der nicht regulierten Energieabgabe in Photosystem II (Y(NO)) der vielversprechendste Parameter für das Screening von gegenüber Braunrost resistenten Weizenpflanzen ist. Die Messungen dokumentieren, dass der Pathogen-induzierte Anstieg von Y(NO) in der anfälligen Sorte stärker ausgeprägt war als in der resistenten Sorte. Der geeignetste Zeitpunkt für eine verlässliche Differenzierung war zwei Tage nach der Inokulation (dai). Vorangegangene Versuche mit Sporendichten von 20.000 Sporen/ml im Falle von Parametern der schnellen und von 100.000 Sporen/ml bei Parametern der langsamen Fluoreszenzkinetik haben gezeigt, dass die Änderungen in den Fluoreszenzsignalen nicht auf eine physikalische Maskierung zurückzuführen waren.<br /> Die Erfassung der Fluoreszenzlebenszeit und UV-induzierten Spektren wurde für die Erkennung von Braunrost (P. triticina) bei drei resistenten im Vergleich zu vier anfälligen Sorten eingesetzt. Eine Kombination von spektralen und zeitlich aufgelösten Charakteristika lieferte prä-symptomatische Änderungen der Fluoreszenz, die auf Änderungen im Chlorophyllgehalt sowie sekundären Metaboliten hinwiesen. Die Erfassung des B/G-Amplituden-Verhältnisses scheint der geeignetste Parameter zur Früherkennung einer pilzlichen Infektion zu sein. Eine Unterscheidung zwischen gegenüber Braunrost-sensitiven und -resistenten Sorten erscheint mittels Erfassung des B/R Amplituden-Verhältnisses 3 dai möglich. Dabei sollte allerdings eine zusätzliche Aufnahme der mittleren Fluoreszenzlebenszeit bei 440, 500 und 530 nm Berücksichtigung finden; diese Parameter zeigten nämlich bei den resistenten Sorten ausgeprägtere Unterschiede zwischen Kontroll- und inokulierten Blättern.<br /> UV-induzierte spektrale Signaturen sowie die Mittlere Fluoreszenzlebenszeit sind geeignete Ansätze zur Erfassung von Echtem Mehltau (B. graminis) bereits einen Tag nach Inokulation. Das erniedrigte B/G-Amplituden-Verhältnis sowie die erhöhten G/R- und G/FR-Halbwertsbreiten-Verhältnisse, in inokulierten im Vergleich zu Kontroll-Blättern, waren probate Parameter zur Erkennung des Pilzbefalls. Des Weiteren scheint die erhöhte Mittlere Fluoreszenzlebenszeit in inokulierten Blättern im Wellenlängenbereich von 500-620 nm eine Unterscheidung zwischen gesunden und erkrankten Blättern zu ermöglichen. Zusätzliche Versuche ließen eine erhöhte mittlere Lebenszeit der Grün-Fluoreszenz bereits zehn Stunden nach der ersten Wirt-Pathogen-Interaktion erkennen.<br /> Die Fluoreszenzintensität, gemessen zwischen 370 und 800 nm, stellt einen geeigneten Parameter für eine Diskriminierung zwischen Stickstoffmangel und pilzlicher Erkrankung dar. Das Amplituden-Verhältnis R/FR repräsentiert eine gute Grundlage sowohl für die Früherkennung als auch für eine Differenzierung zwischen N-Vollversorgung, N-Mangel, N-Vollversorgung+Pathogen und N-Mangel+Pathogen. Weitere vielversprechende Ansätze für eine mögliche Diskriminierung zwischen den evaluierten multiplen Stressfaktoren lieferte die Blau-Grün-Fluoreszenz. Darüber hinaus wurden mehrere Amplituden- und Halbwertsbreiten-Verhältnisse für eine Früherkennung der Pathogeninfektion, unabhängig vom Stickstoffversorgungsgrad der Pflanze, als geeignet befunden.