Pasternack, Sandra Maria: Identifizierung und Charakterisierung eines Gens für eine autosomal-rezessive Form der Hypotrichosis simplex: molekulargenetische, zellbiologische und pharmakologische Untersuchungen zum P2RY5-Gen und P2Y5-Protein. - Bonn, 2011. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-23966
@phdthesis{handle:20.500.11811/4907,
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author = {{Sandra Maria Pasternack}},
title = {Identifizierung und Charakterisierung eines Gens für eine autosomal-rezessive Form der Hypotrichosis simplex: molekulargenetische, zellbiologische und pharmakologische Untersuchungen zum P2RY5-Gen und P2Y5-Protein},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2011,
month = jan,

note = {In der vorliegenden Arbeit konnte die molekulare Ursache einer autosomal-rezessiven Form der Hypotrichosis simplex (HS) – einer seltenen, monogen vererbten Haarerkrankung – identifiziert werden. In verschiedenen HS-Familien wurden unterschiedliche Mutationen (c.463C>T, c.373_374delAA) im P2RY5-Gen identifiziert, welches für einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor kodiert.
P2RY5-Expressionsanalysen in verschiedenen Geweben zeigten eine ubiquitäre Expression des Gens. RNA-Analysen an immortalisierten Lymphozyten von Betroffenen machten deutlich, dass die mutierte mRNA vorliegt und nicht durch nonsense-mediated mRNA decay abgebaut wird. Um mehr über die Pathophysiologie zu erfahren, wurden Protein-biochemische Methoden angewandt. In Western-Blot-Analysen mit Zelllysaten von transient transfizierten COS7-Zellen konnten das Wildtyp-Protein und die beiden trunkierten Proteine p.Gln155X und p.Lys125AsnfsX37 nachgewiesen und das ungefähre Molekulargewicht bestimmt werden. Mittels Immunfluoreszenz-Analysen konnte demonstriert werden, dass das P2Y5-Wildtyp-Protein in der Zellmembran lokalisiert ist, wohingegen die trunkierten Proteine im endoplasmatischen Retikulum vorliegen. Die Aufnahme von adäquaten externen Reizen durch die P2Y5-Mutanten ist also nicht möglich, da diese Proteine nicht in die Zellmembran integriert werden.
In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Bonn konnte mittels eines CRE-Luziferase-gekoppelten Reportergen-Assays oleoyl-L-α-Lysophosphatidsäure (LPA), ein bioaktives Lipid, als Ligand des P2Y5-Rezeptors identifiziert werden. Bei diesem Assay kam es nach Aktivierung des Rezeptors durch LPA zur Aktivierung der CRE-induzierten Luziferase-Aktivität, d. h. die Signalweiterleitung in der Zelle könnte über den Second Messenger cAMP stattfinden. Durch Radioliganden-Bindungsstudien konnte anschließend verifiziert werden, dass der P2Y5-Rezeptor LPA bindet. Durch die Identifizierung von P2Y5 als LPA-Rezeptor wächst die Anzahl der bekannten LPA-Rezeptoren von fünf (LPA1-5/LPAR1-5) auf sechs. Der P2Y5-Rezeptor wurde daraufhin entsprechend seiner Funktion in LPAR6 (lysophosphatidic acid receptor 6) umbenannt. Der Konsistenz wegen wird hier weiterhin die Bezeichnung P2Y5 verwendet. Basierend auf Homologiestudien ist P2Y5 in eine Subgruppe von LPA-Rezeptoren einzuordnen, die LPA4 und LPA5 umfasst. Diese beiden Rezeptoren sind nicht im Haarfollikel exprimiert, sodass ein Verlust von P2Y5 wahrscheinlich nicht durch homologe Rezeptoren kompensiert werden kann und es deshalb zum Haarausfall kommt. In anderen Geweben, wie Haut, Lymphozyten oder Augenbrauen, konnte LPA4- und/oder LPA5-Expression nachgewiesen werden. Da es in keinem dieser Gewebe zu phänotypischen Veränderungen kommt, ist anzunehmen, dass LPA4, LPA5 und P2Y5 redundant in ihrer Funktion sind und LPA4 und LPA5 den P2Y5-Verlust kompensieren können.
Expressionsuntersuchungen von Lpa-Rezeptoren an murinen Haarfollikeln lassen darauf schließen, dass eine dem Menschen ähnliche Konstellation vorliegt, da P2ry5, nicht jedoch Lpa4 und Lpa5, exprimiert sind. Aus diesem Grund wurde der murine P2Y5-Rezeptor in einen knockout-Vektor kloniert, um eine knockout-Maus zu generieren. Da uns keine Haut- oder Haarbiopsien von den Betroffenen der untersuchten HS-Familien zur Verfügung stehen, wird eine knockout-Maus dazu dienen, weiterführende histologische Untersuchungen durchführen zu können und die Pathophysiologie des Haarausfalls bzw. des Haarwachstums zu verstehen.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmalig die essentielle Rolle und spezifische Funktion eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors (P2Y5) für das menschliche Haarwachstum beschrieben werden. Darüber hinaus konnte durch die Identifizierung des endogenen Liganden ein Modell von der P2Y5-Wirkungsweise erstellt werden. Da diese Rezeptoren geeignete drug-targets darstellen, könnten P2Y5 und dessen Ligand LPA zur Herstellung von Wirkstoffen von Bedeutung sein, die pharmazeutisch bei Haarausfall genutzt werden können. Sie könnten auch die Entwicklung neuer lipophiler LPA-Analoga vorantreiben, wodurch Möglichkeiten für neue therapeutische Ansätze zur Behandlung von Haarausfall aufgezeigt werden können. Ob diese dann auch bei anderen Haarerkrankungen, wie der androgenetischen Alopezie oder der Alopecia areata wirkungsvoll sein könnten, muss noch untersucht werden.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/4907}
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