Etablierung eines konditionalen Expressionssystems zur Analyse des Transkriptionsfaktors Sox2 in murinen und humanen ES-Zellen

Abstract

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind sowohl für die Entwicklungsbiologie als auch für die biomedizinische Forschung von besonderem Interesse. Humane ES-Zellen eröffnen die Möglichkeit, <em>in vitro</em> neue Erkenntnisse über die frühe Embryonalentwicklung des Menschen zu gewinnen. Das <em>high mobilty group</em> DNA Bindeprotein Sox2 ist einer der Schlüsselfaktoren während der Embryogenese der Maus, sowohl in der Präimplantationsphase als auch in der frühen neuralen Entwicklungsphase. Im Rahmen dieser Dissertation sollte die funktionale Rolle des Transkriptionsfaktors SOX2 insbesondere in der frühen neuralen Differenzierung von humanen ES-Zellen analysiert werden.<br /> Da sich humane ES-Zellen im Vergleich zu murinen ES-Zellen ungleich schlechter genetisch modifizieren lassen, wurde ein genetisches Verfahren entwickelt und optimiert, das eine konditionale und kontrollierbare Transgenexpression in humanen ES-Zellen ermöglicht. Die Anwendung der Proteintransduktionstechnik auf ortsspezifische DNA-Rekombinasen erlaubt die hocheffiziente Regulation konditionaler Genexpressionen. In der vorliegenden Arbeit wurde das FLP-Transduktions-System, für die Verwendung in murinen ES-Zellen bis zu einer Rekombinationseffizienz von über 70% optimiert. Die Keimbahngängigkeit von TAT-FLP behandelten ES-Zellen blieb dabei erhalten. Analog zu TAT-FLP wurde eine membranpermeable Version der Dre-Rekombinase entwickelt, um das Spektrum an Rekombinasewerkzeugen zu erweitern.<br /> Mit Hilfe konditionaler Expressionskassetten, die sowohl <em>gain-of-function</em> als auch<em> loss-of-function</em> Studien erlauben, wurde in Kombination mit zell-permeablen Rekombinasen eine funktionelle Analyse des Transkriptionsfaktors Sox2 durchgeführt. Der Cre-induzierbare <em>knockdown</em> von Sox2 zeigte, dass der Transkriptionsfaktor für den Erhalt des undifferenzierten Status von murinen ES-Zellen notwendig ist. Eine Cre-induzierbare Sox2- Überexpression reichte hingegen nicht aus, um murine ES-Zellen in Abwesenheit der extrinsischen Faktoren LIF und BMP4 zu kultivieren, wie es für die Überexpression von Nanog, einem weiteren Pluripotenzfaktor, beschrieben ist. Eine Cre-induzierbare SOX2- Überepression in humanen ES-Zellen ist ebenfalls nicht in der Lage, die Pluripotenz in Abwesenheit des extrinsischen Pluripotenzfaktors bFGF aufrecht zu erhalten. Allerdings ergab die Genexpressionsanalyse ausgewählter Marker, dass in SOX2-überexprimierenden Zellen während der Differenzierung die Pluripotenz-assoziierten Gene LEFTY, NANOG und OCT3/4 hochreguliert sind. Dies scheint ein Indiz dafür zu sein, dass in spontan differenzierenden Zellen die SOX2-Überexpression einen stabilisierenden Effekt auf das Pluripotenznetzwerk in humanen ES-Zellen ausübt und der Differenzierungsprozess dadurch zeitlich verzögert abläuft. Immunzytologische Färbungen gegen Marker aller drei Keimblätter wiesen auf einen neuro-induktiven Effekt der SOX2-Überexpression während der spontanen Differenzierung hin. Dieser neuro-induktive Effekt wurde bei der direkten Konversion von humanen ES-Zellen in neurale Vorläuferzellen bestätigt. SOX2-überexprimierende humane ES-Zellen differenzierten überwiegend in neurale PAX6-positive Zellen, welche sich darüber hinaus spontan zu neuralen Rosetten anordneten. Die Untersuchungen dieser Arbeit weisen auf eine konservierte Rolle von Sox2 bei Maus und Mensch in der frühen neuralen Differenzierung hin.