Expressionssysteme zur Untersuchung der Pederin- und Psymberin-Biosynthese aus nicht kultivierten bakteriellen Symbionten

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Expression und Charakterisierung von Enzymen der Pederin- und Psymberin-Biosynthese sowie mit den Fortschritten in der heterologen Expression des Pederin-Genclusters. Pederin und Psymberin werden von bakteriellen Symbionten produziert. Der Pederin-Produzent hat eine Symbiose mit Käfern der Gattung <i>Paederus</i> und <i>Paederidus</i> ausgebildet, wogegen der Psymberin Produzent aus dem Schwamm <i>Psammocinia</i> aff. <i>bulbosa</i> stammt. Sowohl Pederin als auch Psymberin zeichnen sich durch eine sehr hohe antitumorale Wirksamkeit aus. Die Biosynthese wird über Typ I Polyketidsynthasen (PKS) realisiert, deren Acyltransferasen (AT) in <i>trans</i> agieren. Die PKS hat einen modularen Aufbau, wobei jedes Modul in einzelne Domänen untergliedert ist. In die Psymberin-PKS sind dabei eine während bei der Pederin-PKS zwei Nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS)-Module integriert. Im Zentrum dieser Arbeit steht die Expression, Reinigung und Charakterisierung verschiedener Enzyme der Psymberin- und Pederin-Biosynthese. Als Ziel dieser Experimente steht die enzymatische <i>in vitro</i>-Erforschung der Einführung von ß-Verzweigungen, a-Hydroxylierungen und ß-Methoxylierungen in Polyketide am Beispiel von Pederin und Psymberin. Diese ungewöhnlichen Biosyntheseschritte waren zu Beginn dieser Arbeit noch nicht näher charakterisiert und könnten Potential für die kombinatorische Polyketid-Biosynthese zur Generierung nicht natürlicher Polyketide besitzen. Ein weiteres sehr zentrales Thema stellt die Charakterisierung der <i>trans</i>-AT-katalysierten Acylierungsreaktion der Acylcarrierproteine (ACP) dar.<br /> Auf Basis von Vorarbeiten, die aus der initialen Charakterisierung der AT PedD und ihrer Substratübertragungsreaktion auf die ACPs PedN und die Doppel-ACP von PedI3 bestanden, wurden diese Experimente erweitert und mit einem ganzen Modul (PedI3) des Pederin-Biosynthese-Gencluster sowie zwei einzelnen modularen ACPs (PsyA-ACP₃ und PsyD-ACP₁) des Psymberin-Clusters durchgeführt. Das Modul PedI3 konnte hierzu als His₈-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt werden. Zusätzlich wurde PedI3 fusioniert mit zwei Linkersequenzen der Erythromycin-PKS sowie einer Linkersequenz von PedF als His₈-Linker-PedI3-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt. Dabei erwies sich die Co-Expression von Chaperonen, durch die eine 6 bis 11 fach erhöhte Zielproteinkonzentration in den Elutionsfraktionen erzielt wurde, als sehr hilfreich. Ebenfalls als His₈-Fusionsprotein konnten die ACPs PsyA-ACP₃ und PsyD-ACP₁ exprimiert und gereinigt werden. Eine Umwandlung der ACPs von der inaktiven <i>apo</i>- in die aktive <i>holo</i>-Form konnte durch die Co-Expression der Phosphopantetheinyltransferase (PPTase) Svp aus <i>Streptomyces verticillus</i> ATCC15003 durchgeführt werden. Der Nachweis der erfolgten Phosphopantetheinylierung wurde an PsyA-ACP₃ mittels MALDI-TOF-TOF-MS und LC-MS nachgewiesen. Der Nachweis der Phosphopantetheinylierung von PedI3 und PsyD-ACP₁ erfolgte indirekt über eine erfolgreiche Substratübertragung auf die putative <i>holo</i>-Form sowie fehlender Acylierung der vermeintlichen <i>apo</i>-Form. Bei dem Einsatz der Enzyme in Assays mit radioaktiv markierten Substraten zeigte sich, dass PedD in der Lage ist, Malonyl-CoA auf die <i>holo</i>-Form von PedI3 und dessen Linkerfusionsprodukten sowie auf PsyA-ACP₃ und PsyD-ACP₁ zu übertragen. Keine Übertragung erfolgt bei einem Einsatz von Acetyl-CoA und der Verwendung der jeweiligen <i>apo</i>-Form der ACPs. Diese Ergebnisse bestätigen die Substratspezifität und fehlende ACP-Spezifität von PedD und zeigen dies spezifischer, da die PedD-mediierte Substratbeladung an einem ganzen Modul getestet wurde. Um die Substratübertragungsreaktion von PedD kinetisch zu untersuchen, wurde die enzymatische Reaktion an einen bereits bekannten a-Ketoglutaratdehydrogenase Assay gekoppelt. Dabei konnten die kinetischen Daten bei 10 °C für die PedD-katalysierte Substratübertragung auf die ACPs PedN und PsyA-ACP₁ sowie die Selbstacylierungsreaktion der ACPs ermittelt werden. Für die PedD-katalysierte Substratübertragung auf PedN ergab sich ein Wert für K_M von 2,3 µM, für k_cat von 0,045 s^-1 sowie für k_cat x K_M^-1 von 0,019 s^-1 x µM^-1. Die PedD-katalysierte Substratübertragung auf das ACP PsyA-ACP₃ zeigte einen K_M von 1,7 µM, einen k_cat von 0,044 s^-1 sowie einen k_cat x K_M^-1 von 0,0257 s^-1 x µM^-1. Die Selbstacylierungsreaktion von PedN ergab für K_M 54 µM, für k_cat 0,005 s^-1 sowie für k_cat x K_M^-1 0,00009 s^-1 x µM^-1. Die Selbstacylierungsreaktion von PsyA-ACP₃ wurde K_M zu 131 µM, k_cat zu 0,0059 s^-1 sowie k_cat x K_M^-1 zu 0,000045 s^-1 x µM^-1 ermittelt. Für die zweite AT PedC konnte bisher keine Substratübertragung auf die ACPs nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse stammen aus Studien mit einem Fusionsprotein aus Maltosebindeprotein und PedC. Um diese fehlende Aktivität zu bestätigen oder zu widerlegen, wurde PedC mit einem kurzen Strep Tag II Affinitäts-Tag fusioniert und unter Co-Expression von Chaperonen exprimiert und gereinigt. Der Einsatz von PedC in Assays mit radioaktiv markiertem Malonyl- und Acetyl-CoA zeigte, dass PedC auch als Fusion mit dem Strep Tag II nicht in der Lage ist, die Substrate zu akzeptieren. Insgesamt ist PedD somit für die Übertragung aller Elongationssubstrate (Malonyl-CoA) auf die ACPs während der Pederin-Biosynthese zuständig. Außerdem liefern die Experimente mit den ACPs PsyA-ACP₃ und PsyD-ACP₁ die ersten funktionellen Daten zum Psymberin-Cluster.<br /> Zu Beginn dieser Arbeit war die Einführung von ß-Verzweigungen in Polyketide völlig unerforscht. Daher sollte am Beispiel der Einführung der Exomethylengruppe im Pederin diese enzymatischen Schritte näher beleuchtet werden. Hierzu wurden als zentraler Bestandteil das Modul PedI3 und dessen genannte Linkerfusionsprodukte exprimiert und aufgereinigt. Die Aktivität von PedI3 und dessen Linkerfusionsprodukte konnte aufgrund der Substratakzeptanz gegenüber Malonyl-CoA nachgewiesen werden. Weitere akzessorische Proteine, die bei der Biosynthese involviert sein sollten, sind das ACP PedN, die Ketosynthase (KS) PedM, das HMGCoA-Synthase-artige Protein (HMGS) PedP und die Crotonase (CR) PedL. Für PedN stand bereits ein funktionierendes Expressionssystem zur Verfügung. PedM und PedP waren bereits kloniert und konnten im Rahmen dieser Arbeit als His₈-Fusionsproteine unter Co-Expression von Chaperonen exprimiert und gereinigt werden. PedL wurde neu kloniert und konnte als His₈-Fusionsprotein sowie als StrepTag II-PedL-His₁₀-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt werden. Somit wurde durch die Expressionen die enzymatische Grundlage für die Assays gelegt. Allerdings zeigte sich in der massenspektrometrischen Analytik die Problematik, dass die Detektion von Intermediat-beladenen Proteinfragmenten mit den getesteten Methoden, unter anderem aufgrund von Chaperon-Verunreinigungen, nicht erfolgreich war. Die Chaperone konnten auch mit unterschiedlichsten Methoden nicht vom Zielprotein getrennt werden. Daher sind die Proteine für die Assays vorhanden, allerdings müssen in weiteren Arbeiten die analytischen Methoden sowie die Proteinreinigungsmethoden verbessert werden, um eine Analytik der Assays zu ermöglichen.<br /> Kandidaten für die Einführung von a-Hydroxylierungen in Polyketide sind die Enzyme PsyC, eine putative Fe(II) a-Ketoglutarat-abhängige a-Hydroxylase, sowie PsyK, eine putative FAD-abhängige Oxidoreduktase. PsyC konnte als His₈-Fusionsprotein unter Co-Expression von Chaperonen sowie, ohne Chaperon Co-Expressionen, als Fusion mit dem Sumo-Löslichkeits-Tag exprimiert und gereinigt werden. PsyK konnte ebenfalls als His₈-Fusionsprotein sowie als N-terminales und C-terminales Strep-Tag II Protein exprimiert und isoliert werden. Durch ICP-OES Messungen konnte für die PsyC-Elutionsfraktionen nachgewiesen werden, dass PsyC spezifische Eisenkonzentrationen von 1,26 (± 0,59) mol x mol^-1 für die His₈-Fusionsproteine bzw. 1,93 (± 0,70) mol x mol^-1 für die Fusionen mit dem Sumo-Löslichkeits-Tag vorhanden sind. Andere Elemente konnten als Co-Faktoren ausgeschlossen werden. Daher scheint sich die postulierte Funktion von PsyC als Fe(II) a-Ketoglutarat-abhängige a-Hydroxylase zu bestätigen. Zusätzlich konnte über ein Alignment mit anderen Fe(II) a-Ketoglutarat abhängigen a-Hydroxylasen das für diese Enzyme spezifische und konservierte Aminosäure-Motiv His¹-X-Asp/Glu-X_n-His² gefunden werden. Dies verstärkt die Annahme, dass PsyC für die a-Hydroxylierung zuständig ist. Der Einsatz von PsyC in Assays mit dem <i>N</i>-Acetylcysteamin (SNAC)-gekoppelten postulierten Substrat <b>33</b>, dass in Anlehnung an das Intermediat von Modul 3 der Psymberin-Biosynthese synthetisiert wurde, zeigte jedoch keine Umsetzung zu <b>37</b>.<br /> Für den Nachweis der putativ methoxylierenden Funktion der PsyD <i>O</i>-MT Domäne konnte das Enzym als His₈-Fusionsprotein sowie als N-terminales und C-terminales Strep Tag II Fusionsprotein exprimiert werden. Das His₈-Fusionsprotein wurde in Enzymassays mit dem SNAC-Substrat <b>33</b> eingesetzt, jedoch konnte keine Umsetzung zu <b>41</b> nachgewiesen werden.<br /> Die wahrscheinlichste Fehlerquelle bei den erfolgten a-Hydroxylierungsassays und <i>O</i>-Methylierungsassays liegt in der Verwendung des SNAC-Substrates <b>33</b>, da es strukturell nicht identisch zum postulierten Substrat <b>35</b> bzw. <b>36</b> ist und aufgrund der einfacheren Synthese als vereinfachtes Testsubstrat eingesetzt wurde. Daher sollten die Assays in weiteren Experimenten unter Verwendung des postulierten Substrates <b>35</b> bzw. dessen CoA-Ester <b>36 </b>nochmals wiederholt werden. Zur Analyse der Reaktionen an ACP-gebundenen Substraten konnten die ACPs PsyA-ACP₃ und PsyD-ACP₁ bereits erfolgreich exprimiert und isoliert werden.<br /> Neben den Studien an heterolog exprimierten Enzymen der Psymberin- und Pederin-Biosynthese stellen Experimente zur heterologen Expression des kompletten Pederin-Clusters einen weiteren zentralen Punkt dieser Arbeit dar. Als Ausgangspunkt standen <i>Acinetobacter</i> <i>baylyi</i> ADP1 und <i>Pseudomonas stutzeri</i> JM300-Stämme zur Verfügung, die den Gencluster bereits enthielten. Transkriptionsanalysen zeigten eine fehlende Transkription von <i>pedM</i>, <i>N </i>und <i>L</i>. Daher wurden zur Komplementierung der Transkripte Plasmide konstruiert, die <i>pedM, N</i> und <i>L </i>unter der Regulation des <i>pedC</i>/<i>pedD</i>-Promotors enthalten. Folgende Transkriptionsanalysen zeigten die komplementierende Funktion von <i>pedM</i>, <i>N </i>und <i>L</i> der Plasmide, sodass auf Ebene der Transkription alle Gene des Pederin-Clusters transkribiert wurden. Allerdings konnte aus Kultivierungen der entsprechenden Stämme weder Pederin noch Biosynthese-Intermediate des Pederins detektiert werden. Theoretische Untersuchungen auf Basis des Codongebrauchs konnten mögliche Gründe für die fehlenden Metabolite aufdecken. Gravierende Unterschiede bezüglich der relativen Adaptivitäten von AGG und CGG (jeweils kodierend für Arg) zeigten sich bei <i>Acinetobacter</i> <i>baylyi</i> ADP1 bei einem Vergleich mit dem Pederin-Cluster. Auch bei <i>Pseudomonas</i> sp. konnte ein moderater Unterschied bezüglich der relativen Adaptivitäten für die Codons AGA und AGG (Arg), ATA (Ile) sowie CTA, CTT und TTA (kodierend für Leu) festgestellt werden. Daher könnte eine Ursache für die fehlende Metabolitproduktion in der Translation zu finden sein.

<strong>Expression systems for the analysis of the Pederin and Psymberin biosynthesis from uncultivated bacterial symbionts</strong><br /> Presented here are expression and characterization studies of enzymes of the pederin and psymberin biosynthesis. Moreover proceedings in the heterologous expression of the complete pederin gene cluster are reported. Pederin and psymberin are produced by bacterial symbionts. The pederin producer assumes a symbiosis with beetles from the genus <i>Paederus</i> and <i>Paederidus</i>, and the psymberin producer coexists with the sponge <i>Psammocinia</i> aff. <i>bulbosa</i>. Both natural products are highly active antitumor compounds. The biosynthesis is performed by a type I polyketide synthase (PKS), in which the acyltransferases (AT) act in <i>trans</i>. The PKS is organized in modules, and the modules are organized in enzymatically active domains. The pederin PKS contains two modules of nonribosomal peptide synthetases (NRPS) whereas the psymberin PKS harbours only one NRPS-modul.<br /> The main aspect of this work is the expression, purification and characterization of various enzymes of the psymberin and pederin cluster. The aim was to elucidate biosynthetic steps like β-branch formation, α-hydroxylations and β-methoxylations in the biosynthesis of pederin and psymberin by <i>in vitro</i> assays with the isolated enzymes. These functionalisations of polyketides are novel and uncommon and have great potential in combinatorial biosynthesis and in the generation of unnatural polyketides. The characterization of the <i>trans</i>-AT mediated acylation of acylcarrierproteins (ACPs) is another central topic of this study.<br /> After the initial characterization of the PedD AT-mediated substrate transfer to the ACPs PedN and the double ACP from PedI3 by Katrin Zimmermann, the experiments were expanded and the reactions were realized with the complete module PedI3 and with the modul-integrated ACPs PsyA-ACP₃ and PsyD-ACP₁ from the psymberin cluster. In addition, three different fusion proteins of PedI3 and PKS-linkers were tested in the reactions. The origins of the linker sequences were the erythromycin PKS (EryA) and the pederin PKS (PedF). All proteins were expressed and purified as His₈-fusion proteins. For the expression of PedI3 and the linker fusions a co-expression of chaperones was established. Using this method, the target proteins were isolated in a 6 to 11 times higher yield as compared to expressions without co-expression of chaperones. The conversion of the inactive <i>apo</i>-ACPs to the active <i>holo</i>-ACPs was performed by using the phosphopantetheinyltransferase (PPTase) Svp of <i>Streptomyces verticillus</i> ATCC15003. In case of PsyA-ACP₃, MALDI-TOF-TOF-MS and LC-MS were used for the detection of the phosphopantetheinylation. In case of PedI3, its linker fusions and PsyD-ACP₁ analysis was successful by an indirect reaction assays using radioactive substrates. In the latter, putative <i>holo</i>-forms of the ACPs were acylated whereas no acylation was observed for the <i>apo</i>-forms. The AT-ACP-assays with radioactively labeled malonyl- and acetyl-CoA showed, that PedD is able to transfer the malonyl-CoA to the <i>holo</i>-forms of PedI3, its linker fusions and to the ACPs PsyA-ACP₃ and PsyD-ACP₁. In case of acetyl-CoA and the <i>apo</i>-forms of the enzymes, no substrate transfer was detected. These results demonstrate an acyl substrate specifity and no ACP specifity of PedD. In addition these results are more specific compared to the transfer to PedN and the double ACP of PedI3, because of using an entire modul. In order to perform a kinetic analysis, the enzymatic reaction was coupled to an already known α-ketoglutaratdehydrogenase assay. The reaction was used successfully for the PedD-mediated malonyl-CoA transfer to the ACPs PedN and PsyA-ACP₃. In addition the self acylation reactions of the ACPs were measured. Out of these data kinetic data was calculated. For the PedD-catalyzed substrate transfer to PedN, the K_M is 2,3 µM, the k_cat is 0,045 s^-1 and the k_cat x K_M^-1 is 0,019 s^-1 x µM^-1. For the PedD-catalyzed substrate transfer to the ACP PsyA-ACP₃, the K_M is 1,7 µM, the k_cat is 0,044 s^-1 and the k_cat x K_M^-1 is 0,0257 s^-1 x µM^-1. For the self acylation of PedN, K_M was determined to 54 µM, k_cat to 0,005 s^-1 and k_cat x K_M^-1 to 0,00009 s^-1 x µM^-1. For the PsyA-ACP₃ self acylation, the values are as follows: K_M = 131 µM, k_cat = 0,0059 s^-1 and the k_cat x K_M^-1 = 0,000045 s^-1 x µM^-1. PedC, the other AT from the pederin cluster, seems not to be able to accept and transfer malonyl-CoA or acetyl-CoA. These results were shown by <i>in vitro</i> assays from Katrin Zimmermann where PedC was fused with maltose binding protein. This missing activity should be confirmed or disconfirmed by using PedC fused to a short affinity tag. Therefore PedC was overexpressed under co-expression of chaperones fused as C-terminal Strep tag II protein. The newly created PedC fusion protein was tested in assays with radioactively labeled malonyl- and acetyl-CoA and showed as well no acceptance of the substrates as seen before in case of the maltose binding fusion protein. In summary, PedD is responsible for the transfer of the elongation substrates (malonyl-CoA) to the ACPs during the biosynthesis of pederin.<br /> At the beginning of this study the biosynthesis of β-branches in polyketides was not known. To elucidate the biosynthetic steps, using the example of the pederin exomethylene group, module PedI3 and the already mentioned three linker fusion variants were expressed as His₈-fusion proteins. The activity of these huge proteins was detected by the acceptance of malonyl-CoA substrates. Further accessoric enzymes that should be involved in the reaction are the ACP PedN, the ketosynthase (KS) PedM, the HMGCoA-synthase-like protein (HMGS) PedP and the crotonase (CR) PedL. In case of PedN, a functional expression system already existed. PedM and PedP were already available in cloning vectors, and the expression was performed as a fusion to a His₈-tag under co-expression of chaperones. Cloning and expression of PedL was also performed in this study, and PedL was isolated by co-expression of chaperones as a His₈-fusion protein and as a Strep tag II-PedL-His₁₀-fusion protein. Therefore, all enzymes necessary for the assay were available. The detection of the active site of PedI3 fragments was planned to be measured by mass spectrometry. Due to co-isolation of chaperones, this method was not successful. It was not possible to isolate the target protein from the chaperones, although different methods were tested. In summary, the enzymes for the assays are available, but for the analysis of the assays the protein purification as well as the analytical method has to be improved.<br /> Candidates for the biosynthesis of α-hydroxylations are the psymberin enzymes PsyC, a putative Fe(II) α-ketoglutaric acid-dependent hydroxylase, and PsyK, a putative FAD-dependent oxidoreductase. PsyC was expressed as His_8<-fusion protein under co-expression of chaperones and without co-expression of chaperones as fusion with the Sumo-solubility tag. PsyK was expressed as His₈-fusion protein and as N-terminal and C-terminal Strep-tag II fusion proteins. PsyC elution fractions were analyzed by ICP-OES measurement. The PsyC-specific iron concentrations are 1,26 (± 0,59) mol x mol^-1 in case of the His₈-fusion protein and 1,93 (± 0,70) mol x mol^-1 for the Sumo-solubility tagged protein. Other elements were excluded to act as co-factors. In addition, the alignment to other Fe(II) α-ketoglutaric acid-dependent hydroxylases show that the conserved amino acid motiv His ¹ -X-Asp/Glu-X _n -His ² is present in PsyC. This results intensifies the assumption that PsyC is responsible for the catalysis of α-hydroxylations. PsyC was further tested in enzymatic assays with an <i>N</i>‐acetylcysteamin (SNAC)-ester <b>33</b>, which was synthesized in comparison with intermediate of module 3 of the psymberin-PKS, as substrate. However, mass spectrometric analysis showed no conversion to <b>37</b>. <br /> For the analysis of the putative methoxylation domain PsyD <i>O</i>-MT, the expression of the enzyme as a His₈-fusion protein and as a N-terminal and C-terminal Strep tag II-fusion protein was performed. The His₈-fusion protein was tested in enzymatic assays with the SNAC-ester <b>33</b> as substrate. No conversion to <b>41</b> was detected by mass spectrometry. <br /> The lack in conversion of the α-hydroxylation assay and the methoxylation assay maybe occur due to minor changes in the structure in comparison to the postulated SNAC-substrate <b>35 </b>and <b>36</b>. Therefore, the enzyme assay has to be repeated with the postulated SNAC-substrate <b>35 </b>or the postulated CoA derivative <b>36</b>. In addition, ACP-bound substrates can be used to perform a succesful assay. For this purpose, PsyA-ACP₃ and PsyD-ACP₁ was expressed and purified.<br /> Besides the analysis of single biosynthetic steps of the psymberin and pederin biosynthesis pathway using <i>in vitro</i> assays, the heterologous expression of the complete pederin gene cluster was another impotant part of this work. <i>Acinetobacter baylyi</i> ADP1 and <i>Pseudomonas stutzeri</i> JM 300 were available for this purpose. They already contained the pederin gene cluster. Transcription analysis showed no mRNA of the genes <i>pedN, M</i> and <i>L</i>. Therefore plasmids were cloned that should complement the missing mRNA. <i>pedN, M</i> and <i>L</i> were under the control of the <i>pedC</i>/<i>pedD</i>-promotor. The transcriptional analysis showed the presence of the mRNA of all pederin genes, especially the mRNA of <i>pedN, M</i> and <i>L</i>. Cultivation experiments and analysis of the bacterial extracts did not indicate the presence of pederin or pederin intermediates. The theoretical analysis on the basis of the codon bias seemed to be a possible reason for the missing pederin production. Large differences in the relative adaptiveness was detected for the codons AGG and CGG (encoding for Arg) by comparison of the codon usage of the pederin gene cluster and the codon usage of the strain <i>Acinetobacter baylyi</i> ADP1. Analysis of the codon usage of <i>Pseudomonas</i> sp. and the pederin gene cluster showed moderate differences in the relative adaptivness for the codons AGA and AGG (Arg), ATA (Ile) as well as for CTA, CTT and TTA (encoding for Leu). This leeds to the assumption that the problems are on the translational level.