Epigenetische Regulation entwicklungsspezifischer neuronaler Gene in Neuroblastomzellen

Abstract

Für die Etablierung und Aufrechterhaltung von Entwicklungsabläufen sowohl in sich entwickelnden als auch in adulten Organismen ist die Regelung der Genaktivität durch epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung, Histonacetylierung und Histonmethylierung essentiell. Auf der epigenetischen Ebene stellen die Proteine der Polycombgruppe wichtige Regulatoren der Genrepression dar. Über die EZH2, eine Komponente des Polycombkomplex 2 (PRC2), -vermittelte Histonmodifikation H3K27me3 sind diese in der Lage, Gene stabil über mehrere Zellteilungen hinweg epigenetisch zu hemmen. In genomweiten Studien wurde nachgewiesen, dass die polycomb-vermittelte Histonmodifikation H3K27me3 in ES-Zellen Promotoren wichtiger entwicklungspezifischer Gene, welche Differenzierungsprozesse ermöglichen, hemmen und somit zur Erhaltung der Pluripotenz beitragen. Eine Entfernung der H3K27me3-Histonmodifikation in diesen Zellen resultiert in eine Reexpression der entwicklungsspezifischen Gene. Im Rahmen dieser Arbeit sollte dieser epigenetische Mechanismus an ausgewählten entwicklungsspezifischen Genen in der Tumorentität Neuroblastom untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden zwei epigenetisch wirksame Inhibitoren, Depsipeptid, ein HDAC-Inhibitor und DZNep, EZH2-Inhibitor sowie das Differenzierungsagenz ATRA verwendet. Zunächst wurde die molekulare Wirksamkeit der drei neoplastischen Substanzen auf N- und S-Typ Neuroblastom-Zelllinien getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der Histondeacetylasen durch Depsipeptid das Zellwachstum der NB-Zellen dosis- und zeitabhängig hemmt. Die antiproliferative Hemmung beruhte dabei auf der Induktion eines Zellzyklusarrestes und der Apoptose. Die ATRA-Behandlung induzierte eine mäßige antiproliferative Hemmung in den NB-Zelllinien und es konnte zudem eine Differenzierung der N-Typ Zelllinien unter ATRA festgestellt werden. Darüber hinaus zeigte sich, dass eine Zellzyklusmodulation an der antiproliferativen Hemmung und Differenzierung der Zellen beteiligt war. Die ATRA-Behandlung induzierte keine Apoptose in den Zellen. Unter dem Einfluss des EZH2-Inhibitors DZNep ließ sich ebenfalls eine antiproliferative Hemmung der NB-Zelllinien feststellen, die auf eine Induktion der Apoptose und Zellzyklusmodulation zurückzuführen war. Die apoptoseinduzierende Wirkung von DZNep war weniger stark ausgeprägt als mit Depsipeptid. Zusammenfassend zeigte sich, dass Depsipeptid die stärkste antiproliferative Wirkung unter den drei Inhibitoren hatte.<br /> Für die Analyse der polycomb-vermittelten, entwicklungs-spezifischen Gene in NB-Zellen wurden in einer Pilot-Studie mit Depsipeptid zehn entwicklungsspezifische Gene untersucht. Unter dem Einfluss von Depsipeptid zeigte sich dabei unter anderem eine starke Aktivierung der drei neurospezifischen Gene NEUROG1, NKX2-2 und OLIG2 in den NB-Zelllinien, welche für weitere Untersuchungen verwendet wurden. Die deutliche Aktivierung der Gene mit Depsipeptid ging jedoch nicht mit einer Veränderung der polycomb-vermittelten Histonmodifikation H3K27me3 einher. Vielmehr war eine deutliche Anreicherung der H3K9-Acetylierug für die Hochregulation der Gene verantwortlich. ATRA zeigte eine Zelltyp-spezifische mäßige Aktivierung der drei Gene. Diese leicht induzierte Aktivierung ging entweder mit einer Erhöhung der aktivierenden Histonmodifikation H3K4me3 oder mit einer Abnahme der polycomb-assoziierten Histonmodifikation H3K27me3 einher. Unter dem Einfluss von DZNep ließ sich trotz Abnahme der polycomb-assoziierten Histonmodifikation H3K27me3 an einigen Promotoren keine Aktivierung dieser Gene feststellen. Des Weiteren zeigte sich, dass DZNep keinen selektiven Inhibitor der EZH2-vermittelten Histonmodifikation H3K27me3 darstellte, da es auch einen herunterregulierenden Einfluss auf die aktivierende Histonmodifikation H3K4me3 hatte. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass die Depsipeptid-induzierte Acetylierung von H3K9 die polycomb-vermittelte Histonmodifikation H3K27me3 außer Kraft setzen kann, um neuronal spezifische Entwicklungs-PcG-Zielgene zu aktivieren.