Molekulare und Physiologische Analyse der MRS2-Genfamilie von Magnesiumtransportern in Arabidopsis thaliana
Molekulare und Physiologische Analyse der MRS2-Genfamilie von Magnesiumtransportern in Arabidopsis thaliana
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DissertationDate of Exam
01.07.2011Date of Publication
15.07.2011Advisor
Knoop, VolkerCo-Referee
Schreiber, LukasMetadata
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Abstract
Magnesium ist an einer großen Vielfalt von biochemischen Vorgängen in allen lebenden Zellen z.B. als Co-Faktor vieler Enzyme, als Zentralatom des Chlorophylls oder als Regulator von zellulären Prozessen beteiligt.Weitere Beispiele für seine essentielle Bedeutung sind die Stabilisierung von ribosomalen Untereinheiten und Ribozymstrukturen sowie die Komplexierung von ATP. Aufgrund seiner besonderen physiko-chemischen Eigenschaften ist das Mg2+-Ion einzigartig unter den biologisch relevanten Kationen und deshalb weisen auch die für seinen Membrantransport zuständigen Proteine außergewöhnliche Merkmale auf. Das zur Zeit am besten untersuchten Transportsystem für Mg2+ ist das bakterielle CorA Protein, gefolgt von seinem eukaryontischen Verwandten Mrs2p aus der inneren Mitochondrienmembran der Hefe. Weitere Homologe existieren in den Metazoa und im Reich der Pflanzen, wo sie sogar ganze Genfamilien bilden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob und welche Mitglieder der Arabidopsis thaliana MRS2 Genfamilie zueinander redundant sind. Aus diesem Grund wurden multiple Arabidopsis Knockout-Linien für die drei eng verwandten Mitglieder MRS2-1, MRS2-5 und MRS2-10 hergestellt und charakterisiert. Die Ergebnisse deuten an, dass die beiden am nächsten zueinander verwandten Gene MRS2-1 und MRS2-10 funktionell redundant sind und die Pflanze eines der beiden Proteine für ihr Überleben benötigt. Das MRS2-5 Gen hingegen schien unter den untersuchten Bedingungen keine essentielle Funktion zu besitzen. Vorangegangene Studien zeigten, dass ein Knockout für die meisten anderen Mitglieder der Genfamilie nicht möglich ist. Für einige dieser Kandidaten konnte durch post-transkriptionelles Gen-Silencing das Transkriptionsniveau deutlich reduziert werden, ohne jedoch zu einem offensichtlichen Phänotyp zu führen.
Aus einer früheren Untersuchung lag bereits eine mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem Mg2+-abhängigen Phänotyp vor, die nun weiter physiologisch charakterisiert werden sollte. Eine ektopische Überexpression der codierenden Sequenz von MRS2-7 unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors hob diesen Phänotyp vollständig auf, während ein alternatives Konstrukt mit der genomischen DNA und dem endogenen Promotor hierzu nicht in der Lage war. Die Überexpression von MRS2-7 bewirkte außerdem eine erkennbar gesteigerte Toleranz gegenüber toxischen Al3+-Ionen bei Wachstum unter sauren pH-Bedingungen.
Um das Wissen über die subzelluläre Lokalisation der verschiedenen MRS2 Proteine zu erweitern, wurden einige Mitglieder der Genfamilie in co-translatorischer Fusion mit dem grün fluoreszierenden Protein in Epidermiszellen von Tabakblättern transient exprimiert. Alle sechs untersuchten Proteine konnten unabhängig von der Positionierung des Reporters im Endomembransystem der Zelle detektiert werden. Diese Ergebnisse müssen jedoch kritisch hinterfragt werden, da ein Versuch die mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem MRS2-7:GFP Fusionsprotein zu komplementieren nicht gelang. Die stabile Expression dieses Konstruktes führte in Arabidopsis zu keiner erkennbaren Fluoreszenz, und nur ein deutlich verkürztes Fusionsprotein konnte immunologisch nachgewiesen werden.
Ein vielseitiges Instrument um die Funktion eines unbekannten Proteins zu untersuchen ist die Verwendung eines heterologen Expressionssystems. Mit Hilfe der mrs2Δ Mutante der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurden neun Mitglieder der MRS2 Genfamilie als funktionelle Magnesiumtransporter identifiziert. Durch Transportmessungen mit einem Mg2+-sensitiven Farbstoff konnten die Aufnahmekapazitäten der einzelnen MRS2 Proteine bestimmt werden. Als ein alternatives System zur funktionellen Charakterisierung von Mg2+-Transportproteinen wurde durch die Anwendung von homologer Rekombination ein Escherichia coli Stamm erzeugt, dem seine beiden endogenen Magnesiumtransporter CorA und MgtA fehlen. Dieser Stamm benötigt für sein Wachstum im Gegensatz zum Wildtyp oder den ΔcorA bzw. ΔmgtA Einzelmutanten zusätzliches Magnesium im Medium. Erste Versuche zur Komplementation der ΔcorA ΔmgtA Doppelmutante mit den pflanzlichen MRS2 Proteinen waren allerdings erfolglos.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob und welche Mitglieder der Arabidopsis thaliana MRS2 Genfamilie zueinander redundant sind. Aus diesem Grund wurden multiple Arabidopsis Knockout-Linien für die drei eng verwandten Mitglieder MRS2-1, MRS2-5 und MRS2-10 hergestellt und charakterisiert. Die Ergebnisse deuten an, dass die beiden am nächsten zueinander verwandten Gene MRS2-1 und MRS2-10 funktionell redundant sind und die Pflanze eines der beiden Proteine für ihr Überleben benötigt. Das MRS2-5 Gen hingegen schien unter den untersuchten Bedingungen keine essentielle Funktion zu besitzen. Vorangegangene Studien zeigten, dass ein Knockout für die meisten anderen Mitglieder der Genfamilie nicht möglich ist. Für einige dieser Kandidaten konnte durch post-transkriptionelles Gen-Silencing das Transkriptionsniveau deutlich reduziert werden, ohne jedoch zu einem offensichtlichen Phänotyp zu führen.
Aus einer früheren Untersuchung lag bereits eine mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem Mg2+-abhängigen Phänotyp vor, die nun weiter physiologisch charakterisiert werden sollte. Eine ektopische Überexpression der codierenden Sequenz von MRS2-7 unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors hob diesen Phänotyp vollständig auf, während ein alternatives Konstrukt mit der genomischen DNA und dem endogenen Promotor hierzu nicht in der Lage war. Die Überexpression von MRS2-7 bewirkte außerdem eine erkennbar gesteigerte Toleranz gegenüber toxischen Al3+-Ionen bei Wachstum unter sauren pH-Bedingungen.
Um das Wissen über die subzelluläre Lokalisation der verschiedenen MRS2 Proteine zu erweitern, wurden einige Mitglieder der Genfamilie in co-translatorischer Fusion mit dem grün fluoreszierenden Protein in Epidermiszellen von Tabakblättern transient exprimiert. Alle sechs untersuchten Proteine konnten unabhängig von der Positionierung des Reporters im Endomembransystem der Zelle detektiert werden. Diese Ergebnisse müssen jedoch kritisch hinterfragt werden, da ein Versuch die mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem MRS2-7:GFP Fusionsprotein zu komplementieren nicht gelang. Die stabile Expression dieses Konstruktes führte in Arabidopsis zu keiner erkennbaren Fluoreszenz, und nur ein deutlich verkürztes Fusionsprotein konnte immunologisch nachgewiesen werden.
Ein vielseitiges Instrument um die Funktion eines unbekannten Proteins zu untersuchen ist die Verwendung eines heterologen Expressionssystems. Mit Hilfe der mrs2Δ Mutante der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurden neun Mitglieder der MRS2 Genfamilie als funktionelle Magnesiumtransporter identifiziert. Durch Transportmessungen mit einem Mg2+-sensitiven Farbstoff konnten die Aufnahmekapazitäten der einzelnen MRS2 Proteine bestimmt werden. Als ein alternatives System zur funktionellen Charakterisierung von Mg2+-Transportproteinen wurde durch die Anwendung von homologer Rekombination ein Escherichia coli Stamm erzeugt, dem seine beiden endogenen Magnesiumtransporter CorA und MgtA fehlen. Dieser Stamm benötigt für sein Wachstum im Gegensatz zum Wildtyp oder den ΔcorA bzw. ΔmgtA Einzelmutanten zusätzliches Magnesium im Medium. Erste Versuche zur Komplementation der ΔcorA ΔmgtA Doppelmutante mit den pflanzlichen MRS2 Proteinen waren allerdings erfolglos.
Subjects
Magnesiumtransport, Pflanzenphysiologie, MRS2 Genfamilie
Classification (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieGebert, Michael: Molekulare und Physiologische Analyse der MRS2-Genfamilie von Magnesiumtransportern in Arabidopsis thaliana. - Bonn, 2011. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-25579
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-25579
@phdthesis{handle:20.500.11811/4989,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-25579,
author = {{Michael Gebert}},
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year = 2011,
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Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob und welche Mitglieder der Arabidopsis thaliana MRS2 Genfamilie zueinander redundant sind. Aus diesem Grund wurden multiple Arabidopsis Knockout-Linien für die drei eng verwandten Mitglieder MRS2-1, MRS2-5 und MRS2-10 hergestellt und charakterisiert. Die Ergebnisse deuten an, dass die beiden am nächsten zueinander verwandten Gene MRS2-1 und MRS2-10 funktionell redundant sind und die Pflanze eines der beiden Proteine für ihr Überleben benötigt. Das MRS2-5 Gen hingegen schien unter den untersuchten Bedingungen keine essentielle Funktion zu besitzen. Vorangegangene Studien zeigten, dass ein Knockout für die meisten anderen Mitglieder der Genfamilie nicht möglich ist. Für einige dieser Kandidaten konnte durch post-transkriptionelles Gen-Silencing das Transkriptionsniveau deutlich reduziert werden, ohne jedoch zu einem offensichtlichen Phänotyp zu führen.
Aus einer früheren Untersuchung lag bereits eine mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem Mg2+-abhängigen Phänotyp vor, die nun weiter physiologisch charakterisiert werden sollte. Eine ektopische Überexpression der codierenden Sequenz von MRS2-7 unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors hob diesen Phänotyp vollständig auf, während ein alternatives Konstrukt mit der genomischen DNA und dem endogenen Promotor hierzu nicht in der Lage war. Die Überexpression von MRS2-7 bewirkte außerdem eine erkennbar gesteigerte Toleranz gegenüber toxischen Al3+-Ionen bei Wachstum unter sauren pH-Bedingungen.
Um das Wissen über die subzelluläre Lokalisation der verschiedenen MRS2 Proteine zu erweitern, wurden einige Mitglieder der Genfamilie in co-translatorischer Fusion mit dem grün fluoreszierenden Protein in Epidermiszellen von Tabakblättern transient exprimiert. Alle sechs untersuchten Proteine konnten unabhängig von der Positionierung des Reporters im Endomembransystem der Zelle detektiert werden. Diese Ergebnisse müssen jedoch kritisch hinterfragt werden, da ein Versuch die mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem MRS2-7:GFP Fusionsprotein zu komplementieren nicht gelang. Die stabile Expression dieses Konstruktes führte in Arabidopsis zu keiner erkennbaren Fluoreszenz, und nur ein deutlich verkürztes Fusionsprotein konnte immunologisch nachgewiesen werden.
Ein vielseitiges Instrument um die Funktion eines unbekannten Proteins zu untersuchen ist die Verwendung eines heterologen Expressionssystems. Mit Hilfe der mrs2Δ Mutante der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurden neun Mitglieder der MRS2 Genfamilie als funktionelle Magnesiumtransporter identifiziert. Durch Transportmessungen mit einem Mg2+-sensitiven Farbstoff konnten die Aufnahmekapazitäten der einzelnen MRS2 Proteine bestimmt werden. Als ein alternatives System zur funktionellen Charakterisierung von Mg2+-Transportproteinen wurde durch die Anwendung von homologer Rekombination ein Escherichia coli Stamm erzeugt, dem seine beiden endogenen Magnesiumtransporter CorA und MgtA fehlen. Dieser Stamm benötigt für sein Wachstum im Gegensatz zum Wildtyp oder den ΔcorA bzw. ΔmgtA Einzelmutanten zusätzliches Magnesium im Medium. Erste Versuche zur Komplementation der ΔcorA ΔmgtA Doppelmutante mit den pflanzlichen MRS2 Proteinen waren allerdings erfolglos.},
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Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob und welche Mitglieder der Arabidopsis thaliana MRS2 Genfamilie zueinander redundant sind. Aus diesem Grund wurden multiple Arabidopsis Knockout-Linien für die drei eng verwandten Mitglieder MRS2-1, MRS2-5 und MRS2-10 hergestellt und charakterisiert. Die Ergebnisse deuten an, dass die beiden am nächsten zueinander verwandten Gene MRS2-1 und MRS2-10 funktionell redundant sind und die Pflanze eines der beiden Proteine für ihr Überleben benötigt. Das MRS2-5 Gen hingegen schien unter den untersuchten Bedingungen keine essentielle Funktion zu besitzen. Vorangegangene Studien zeigten, dass ein Knockout für die meisten anderen Mitglieder der Genfamilie nicht möglich ist. Für einige dieser Kandidaten konnte durch post-transkriptionelles Gen-Silencing das Transkriptionsniveau deutlich reduziert werden, ohne jedoch zu einem offensichtlichen Phänotyp zu führen.
Aus einer früheren Untersuchung lag bereits eine mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem Mg2+-abhängigen Phänotyp vor, die nun weiter physiologisch charakterisiert werden sollte. Eine ektopische Überexpression der codierenden Sequenz von MRS2-7 unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors hob diesen Phänotyp vollständig auf, während ein alternatives Konstrukt mit der genomischen DNA und dem endogenen Promotor hierzu nicht in der Lage war. Die Überexpression von MRS2-7 bewirkte außerdem eine erkennbar gesteigerte Toleranz gegenüber toxischen Al3+-Ionen bei Wachstum unter sauren pH-Bedingungen.
Um das Wissen über die subzelluläre Lokalisation der verschiedenen MRS2 Proteine zu erweitern, wurden einige Mitglieder der Genfamilie in co-translatorischer Fusion mit dem grün fluoreszierenden Protein in Epidermiszellen von Tabakblättern transient exprimiert. Alle sechs untersuchten Proteine konnten unabhängig von der Positionierung des Reporters im Endomembransystem der Zelle detektiert werden. Diese Ergebnisse müssen jedoch kritisch hinterfragt werden, da ein Versuch die mrs2-7 Knockout-Mutante mit einem MRS2-7:GFP Fusionsprotein zu komplementieren nicht gelang. Die stabile Expression dieses Konstruktes führte in Arabidopsis zu keiner erkennbaren Fluoreszenz, und nur ein deutlich verkürztes Fusionsprotein konnte immunologisch nachgewiesen werden.
Ein vielseitiges Instrument um die Funktion eines unbekannten Proteins zu untersuchen ist die Verwendung eines heterologen Expressionssystems. Mit Hilfe der mrs2Δ Mutante der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurden neun Mitglieder der MRS2 Genfamilie als funktionelle Magnesiumtransporter identifiziert. Durch Transportmessungen mit einem Mg2+-sensitiven Farbstoff konnten die Aufnahmekapazitäten der einzelnen MRS2 Proteine bestimmt werden. Als ein alternatives System zur funktionellen Charakterisierung von Mg2+-Transportproteinen wurde durch die Anwendung von homologer Rekombination ein Escherichia coli Stamm erzeugt, dem seine beiden endogenen Magnesiumtransporter CorA und MgtA fehlen. Dieser Stamm benötigt für sein Wachstum im Gegensatz zum Wildtyp oder den ΔcorA bzw. ΔmgtA Einzelmutanten zusätzliches Magnesium im Medium. Erste Versuche zur Komplementation der ΔcorA ΔmgtA Doppelmutante mit den pflanzlichen MRS2 Proteinen waren allerdings erfolglos.},
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