Mobilität endogener mRNA im chromatinfreien Nukleoplasma der Speicheldrüsenzellkerne von <em>Chironomus tentans</em>

Abstract

In eukaryotischen Zellen ist fast die gesamte genetische Information in Form chromosomaler DNA im Zellkern gespeichert, während die molekulare Maschinerie zur Translation ausschließlich cytoplasmatisch lokalisiert ist. Der Transport der genetischen Information aus dem Kern in das Cytoplasma ist einer der wichtigsten Transportprozesse in eukaryotischen Zellen. Er erfolgt mittels sog. messenger ribonucleoprotein particles (mRNPs), die aus der eigentlichen mRNA sowie verschiedenen Proteinen zusammengesetzt sind. Die Dynamik der intranukleären mRNP-Bewegung ist komplex und wird in Säugerzellkernen maßgeblich durch das entfaltete Chromatin beeinflusst. Die spezifischen Wechselwirkungen, bedingt durch die nukleäre Prozessierung der mRNPs, werden in Säugerzellkernen durch die unspezifischen Interaktionen mit dem entfalteten Chromatin verdeckt. Die spezifischen Wechselwirkungen sichtbar zu machen und ihre Kinetik zu analysieren, ist jedoch eine Grundvoraussetzung, um Bindungspartner zu identifizieren und die komplexe mRNP-Prozessierung zu verstehen. <br /> In dieser Arbeit wurde die Mobilität endogener BR2.1 mRNPs in den Speicheldrüsenzellkernen von Chironomus tentans untersucht. In diesen Zellkernen liegt die DNA auch in der Interphase kondensiert vor, in Form so genannter Polytänchromosomen. Hieraus resultieren weite Zellkernbereiche, die frei von dem in Säugerzellen strukturbestimmenden Chromatin sind. Die Mobilität der BR2.1 mRNPs hängt hier nur noch von der Organisation des Nukleoplasmas ab, was die Möglichkeit eröffnet, selektiv nur chromatinunabhängige Wechselwirkungen der BR2.1 mRNPs zu analysieren. <br /> Die nukleäre Diffusion fluoreszenzmarkierter BR2.1 mRNPs wurde mit modernen mikroskopischen Methoden wie Einzelpartikeltracking, FCS und FRAP in vivo mit einer Zeitauflösung im Millisekundenbereich untersucht. Bemerkenswerterweise zeigen die BR2.1 mRNPs auch in Abwesenheit von Chromatinbarrieren eine komplexe Mobilität. Es konnten zwei Mobilitätskomponenten der BR2.1 mRNPs mit Diffusionskoeffizienten von 0.73 µm²/s und 0.3 µm²/s identifiziert werden.<br /> Durch den Vergleich der Mobilität von Dextranmolekülen in Säugerzellkernen mit der in Speicheldrüsenzellkernen konnten in letzteren Nichtchromatinstrukturen im Nukleoplasma nachgewiesen werden, welche die Mobilität sowohl von mRNPs als auch von Dextranmolekülen beeinflussen. Weiter konnte gezeigt werden, dass die Nichtchromatinstrukturen nicht nur als physikalische Barriere, sondern auch durch spezifische Wechselwirkungen eine Retardierung der BR2.1 mRNPs bewirken. Diese transienten Bindungen wurden durch das Protein hrp65 vermittelt und bewirkten auf einer Zeitskala von Millisekunden die gemessenen, scheinbaren Diffusionskoeffizienten.<br /> Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein integriertes Modell der nukleären mRNP-Mobilität in Speicheldrüsenzellkernen aufgestellt werden, welches auch Rückschlüsse auf die mRNP-Diffusion in Säugerzellen erlaubt. Zusätzlich führt es die teilweise widersprüchlichen Ergebnisse zur nukleären mRNP-Mobilität in der Literatur zusammen. Somit zeigte sich, dass nukleoplasmatische Nichtchromatinstrukturen einen wesentlichen Einfluss auf die Mobilität endogener mRNPs haben.