Entwicklung eines kombinierten Lipidtransfer- und Membranfusions-Assays zur Untersuchung membranaktiver Proteine

Abstract

Glykosphingolipide, die aus der Plasmamembran stammen, erreichen nach ihrer Endozytose intraendosomale und intralysosomale Vesikel, auf deren Oberfläche sie von lysosomalen Exohydrolasen abgebaut werden (Übersichtsartikel: Sandhoff und Kolter, 1996). Die intralysosomalen Vesikel unterscheiden sich von der begrenzenden Membran durch das Fehlen einer schützenden Glykokalix und besitzen annähernd kein Cholesterol, dafür aber das lysosomale Markerlipid Bis(monoacylglycero)phosphat.<br /> Zum effektiven Abbau von Lipiden mit nur wenigen Zuckerresten werden zudem wasserlösliche Hilfsproteine, die Sphingolipid-Aktivatorproteine benötigt, welche an der Phasengrenze die Interaktion zwischen membranständigem Substrat und wasserlöslichem Enzym vermitteln. Zu diesen Hilfsproteinen zählen die vier Saposine A-D, kleine, enzymatisch inaktive Glykoproteine, die trotz ihrer hohen Sequenzhomologie unterschiedliche Spezifitäten und Mechanismen aufweisen, und das GM2- Aktivatorprotein.<br /> Das GM2-Aktivatorprotein vermittelt beim Abbau des Gangliosides GM2 die Reaktion mit der β-Hexosaminidase A (3.2.1.52, HexA). Die physiologische Relevanz dieses Proteins wird durch das Auftreten von genetisch bedingten GM2-Aktivatorprotein- Defizienzen (AB-Variante der GM2-Gangliosidosen) belegt, welche zur massiven lysosomalen Speicherung von GM2 und zum frühen Tod führen.<br /> Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Funktion des GM2-Aktivatorproteins beim lysosomalen Abbau zu untersuchen. Von besonderem Interesse war die Frage, inwieweit verschiedene Membranlipide die Interaktion des GM2-Aktivatorproteins mit membrangebundenem GM2 in einem detergenzfreien, liposomalen System beeinflussen und ob der zur Reinigung rekombinant exprimierter Proteine verwendete Hexahistidin-Rest die Funktion membranaktiver Proteine beeinflussen kann.<br /> Ein bereits vorliegendes Präparat aus menschlichem Nierengewebe wurde bezüglich Homogenität und Aktivität untersucht. Zudem wurde ein rekombinantes GM2- Aktivatorprotein mit Hexahistidinrest mittels des Baculovirus-Expressionsvektor-Systems in Insektenzellen exprimiert, dem Präparat aus Gewebe entsprechend charakterisiert und mit diesem verglichen.<br /> Die Wechselwirkung beider GM2-Aktivator-Präperate mit Lipiddoppelschichten wurde mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz <em>(surface plasmon resonance, SPR)</em> untersucht. Hierbei wies das GM2-Aktivatorprotein aus Gewebe eine stark membrandestabilisierende Wirkung auf. Noch während der Überleitung des Proteins kam es zur Ablösung von Lipidmaterial von Chip. Das rekombinante Präparat mit Hexahistidin-Rest zeigte deutlich andere Eigenschaften. Hier konnte nur Anbindung an die Liposomen, aber keine membranauflösende Aktivität nachgewiesen werden.<br /> Um das Verhalten der beiden Proteinpräparate gegenüber Membranen genauer untersuchen zu können, wurde ein neues Verfahren entwickelt, welches den Förster- Resonanz-Energie-Transfer-Assay (Schwarzmann et al., 2005) und den Fusions-Assay mittels magnetischer Separation (Abdul-Hammed et al., 2010) in einem Assay kombinierte. Der entwickelte Assay besteht somit aus zwei Teilen, wodurch es ermöglicht wird zwischen Lipidtransfer und Membranfusion zu unterscheiden, sowie Einblick in die Kinetik der Reaktion zu gewinnen. Anhand dieses kombinierten Lipidtransfer- und Membranfusions-Assays sollten die Eigenschaften des GM2-Aktivatorproteins aus menschlichem Nierengewebe und des rekombinant gewonnenen Präparates mit Hexahistidin-Rest untersucht werden.<br /> Das aus Gewebe gewonnene GM2-Aktivatorprotein vermittelte sowohl Vesikelfusion als auch Transfer von 2-NDB-GM1 zwischen Donor- und Akzeptorvesikeln. Beide Eigenschaften waren abhängig von pH, Ionenstärke und der Lipidzusammensetzung der Modelmembranen. Anionische Lipide, wie das lysosomale BMP, steigerten den Transfer von 2-NBD-GM1 deutlich. Dieses bestätigte vorhergegangene Messungen, welche zeigten, dass für den membrangebundenen Abbau von GM2 beide Komponenten, das GM2-Aktivatorprotein und anionische, lysosomale Phospholipide, benötigt wurden (Werth et al., 2001). Cholesterol, Sphingomyelin und hoher pH-Wert senkten den Lipidtransfer.<br /> Wir konnten zeigen, dass das rekombinant erzeugte GM2-Aktivatorprotein mit Hexahistidin-Rest grundsätzlich stärkere Vesikelfusion vermittelt. Absenkung der Ionenstärke sowie Variation des Cholesterol- oder des BMP-Gehaltes hatten nur sehr geringen Einfluss auf diese fusogenen Eigenschaften. Der Grund dafür schien in der zusätzlichen elektrostatischen Interaktion der bei pH 4,2 negativ geladenen Vesikeloberfläche und dem sechsfach positiv geladenen Hexahistidin-Rest zu liegen. Die einzig signifikante Veränderung bezüglich der Vesikelfusion wurde bei rGM2AP-His6 durch pH-Variation erreicht: Erhöhung des pHs führt zu verringerter Vesikelfusion. Dieses sprach stark dafür, dass die Interaktion der Histidin-Reste mit der Vesikeloberfläche die Vesikelfusion verstärkt, da die positive Ladung des Hexahistidin- Restes bei pH-Erhöhung abnahm.<br /> Die vorliegende Arbeit stellt somit ein neues System vor, welches es in einem Assay ermöglicht die Wechselwirkung von Proteinen mit Lipidvesikeln hinsichtlich ihrer Lipidtransfer- und Vesikelfusionseigenschaften zu untersuchen und zeigt, dass der Hexahistidin-Rest bei der Untersuchung von Lysosomalen Lipid Bindungs Proteinen und anderen membranaktiven Proteinen berücksichtigt werden muss.