Modulation der Neurotransmitterfreisetzung durch präsynaptische Cannabinoid-CB₁-Rezeptoren und andere Rezeptoren

Abstract

Die Freisetzung von Überträgerstoffen (Transmittern) kann durch Rezeptoren gehemmt werden, die häufig direkt an den entsprechenden Nervenendigungen, also präsynaptisch lokalisiert sind. Prominentes Beispiel ist der präsynaptische Cannabinoid-CB₁-Rezeptor, der an inhibitorische G-Proteine koppelt und die Freisetzung verschiedenster Neurotransmitter im zentralen und peripheren Nervensystem hemmt.<br /> Der erste Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit dem endogenen Tonus am CB₁-Rezeptor und seiner Wechselwirkung mit anderen präsynaptischen Rezeptoren. Der inverse CB₁-Rezeptor Agonist Rimonabant steigert die Neurotransmitterfreisetzung. Zur Klärung der Frage, ob dieser endogene Tonus auf einer konstitutiven Aktivität der CB₁-Rezeptoren beruht oder durch den Antagonismus von Rimonabant gegenüber akkumulierenden Endocannabinoiden erklärt werden kann, wird ein neutraler Antagonist benötigt. Zunächst wurde die Affinität der Substanz O-2050, die in der Literatur als neutraler Antagonist beschrieben wurde, am CB₁-Rezeptor mit Radioligandbindungsstudien bestimmt. Sein neutraler Antagonismus konnte schließlich durch die Abwesenheit einer intrinsischen Aktivität in [³⁵S]-GTPγS Bindungsstudien bestätigt werden.<br /> Ein weiterer Teil der Arbeit sollte sich auf die Untersuchung der Wechselwirkung des CB₁-Rezeptors mit anderen präsynaptischen Rezeptoren beziehen. Durch vorherige Aktivierung des CB₁-Rezeptors wird der inhibitorische Effekt des präsynaptischen M₂-Autorezeptors auf die Neurotransmitterfreisetzung abgeschwächt. Umgekehrt ist die Funktion des präsynaptischen M₂-Autorezeptors verstärkt, wenn zuvor der CB₁-Rezeptor pharmakologisch blockiert oder genetisch ausgeschaltet wird. Mithilfe der Western Blot Technik wurde untersucht, ob bei der CB₁-Knockout-Maus eine veränderte Proteinexpression im Hippokampus besteht. Die Expression des M₂-Rezeptors in der CB₁-Knockout-Maus unterschied sich jedoch nicht von derjenigen in der Wildtyp Maus. Als nachgeschalteter Signaltransduktionsweg wurde die Expression von Gα_i- und Gα_o-Proteinen analysiert. Es ergab sich eine leicht verstärkte Expression von beiden G-Proteinen, die jedoch nur im Falle von Gα_o statistisch signifikant war. Der leichte Unterschied könnte möglicherweise die verstärkte M₂-Autorezeptor-Funktion bei der CB₁-Knockout-Maus erklären. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob die Funktion des M₂-Rezeptors auch in FAAH-Knockout-Mäusen beeinträchtigt ist, bei denen es zu einer verstärkten Aktivierung des CB₁-Rezeptors durch eine erhöhte Konzentration des endogenen Cannabinoids Anandamid kommt. Allerdings war in FAAH-Knockout-Mäusen das Ausmaß der M₂-Rezeptor-vermittelten Hemmung der Neurotransmitterfreisetzung nicht verändert.<br /> Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit lag in der Untersuchung der Wirkung von Neuropeptiden und von Interleukin-1β auf die Neurotransmitterfreisetzung. Modulierende Effekte auf die Neurotransmitterfreisetzung sind für viele niedermolekulare Substanzen und für Peptide wie Opioide und Neuropeptid Υ gezeigt worden, jedoch existieren kaum Befunde für weitere Peptide. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Neuropeptid W auf die Noradrenalinfreisetzung im Hippokampus und im Hypothalamus der Maus in Superfusionsstudien untersucht. Neuropeptid W modulierte die Neurotransmitterfreisetzung jedoch nicht. Als weiteres Neuropeptid wurde Neuropeptid FF auf eine mögliche freisetzungsmodulierende Eigenschaft auf die Noradrenalinfreisetzung in der Großhirnrinde und im Vorhof der Maus getestet. Auch diese Substanz zeigte keinen Einfluss. Weiterhin wurde eine Wechselwirkung des Neuropeptid FF ₂-Rezeptors mit dem Opioid-Rezeptor untersucht, da in der Literatur eine Modulation Opioid-Rezeptor-vermittelter Effekte durch Neuropeptid FF mehrfach beschrieben wurde. In unserem Testsystem beeinflusste Neuropeptid FF die Wirkung des δ-Opioidrezeptor Agonisten DPDPE jedoch nicht. Zusätzlich wurde der Einfluss des Zytokins Interleukin-1β auf die Neurotransmitterfreisetzung untersucht. Interleukin-1β hemmte die Noradrenalinfreisetzung, wobei der inhibitorische Effekt interessanterweise erst mit Zeitverzögerung auftrat. Als Ursache wird ein Effekt auf die Proteinbiosynthese angenommen. In allen drei Versuchsserien wurde Sulproston als Referenzpharmakon mitgeführt und führte erwartetermaßen zur Hemmung der Noradrenalinfreisetzung. In den Versuchen zur Identifizierung der Wirkung von Interleukin-1β zeigte Sulproston im Gegensatz zu letzterem eine augenblicklich einsetzende und sich rasch zurückbildende Hemmung.<br /> Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit sollte die Analyse der zentralen Expression des Histamin-H₄-Rezeptors sein. Der bereits Anfang der 90er Jahre postulierte H₄-Rezeptor wurde 2000 als Homolog des H₃-Rezeptors kloniert. Im Gegensatz zum H₃-Rezeptor, dessen Funktion als Modulator der Neurotransmitterfreisetzung gut belegt ist, ist zur präsynaptischen Lokalisation des H₄-Rezeptors wenig bekannt. Da auch die Angaben zur zentralen Lokalisation in der Literatur widersprüchlich sind, wurde in dieser Arbeit die Expression des H₄-Rezeptors mittels RT-PCR in der Großhirnrinde des Menschen und in der Maus untersucht und konnte in der Tat bestätigt werden. Dieser Befund dient als Grundlage für die weitere Untersuchung einer möglichen Beeinflussung der Neurotransmitterfreisetzung durch den H₄-Rezeptor in Superfusionsstudien. Ein inhibitorischer Effekt ist nicht abwegig, da der H₄-Rezeptor, ebenso wie der H₃-Rezeptor, an G_i/o-Proteine koppelt.<br /> Ein letzter Aspekt dieser Arbeit ergab sich im Rahmen eines anderen Projektes in unserer Arbeitsgruppe. Mittels Superfusionsstudien konnte gezeigt werden, dass die durch Prostaglandin E₂ (PGE₂) hervorgerufene Hemmung der Noradrenalin- und Serotoninfreisetzung durch den präsynaptischen EP₃-Rezeptor vermittelt wird. Der kompetitive EP₃-Rezeptor-Antagonist L-826,266 schwächte diese inhibitorische Wirkung von PGE₂ ab. Um seinen Antagonismus näher zu charakterisieren, sollte für den G_i/o-Protein-gekoppelten EP₃-Rezeptor ein [³⁵S]-GTPγS Bindungsmodell entwickelt werden. Der EP_1/3-Rezeptor-Agonist Sulproston beeinflusste die [³⁵S]-GTPγS-Bindung in Hippokampus-Membranen von Maus und Meerschweinchen jedoch nicht, während der Cannabinoid-Rezeptor-Agonist WIN 55,212-2, der als Positivkontrolle mitgeführt wurde, wie erwartet eine ausgeprägte Steigerung der Bindung bewirkte.