Molekularbiologie und Pharmakologie neuer G-Protein-gekoppelter Purin-Rezeptoren

Abstract

Die P0-Rezeptoren bzw. Adenin-Rezeptoren gehören zur Superfamilie der purinergen Rezeptoren. Die beiden identifizierten Adenin-Rezeptoren, Ratten-Adenin-Rezeptor und Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp2, sind über ein inhibitorisches G-Protein an die Adenylatcyclase gekoppelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Mutagenesestudien am Ratten-Adenin-Rezeptor und die Charakterisierung des neu identifizierten Maus-Adenin-Rezeptors Subtyp1 (mMrgA10-Rezeptor) durchgeführt. Für die Überexpression des rekombinanten Proteins mit dem Ziel, Radioligand-Bindungsstudien durchzuführen, wurden Sf9-Insektenzellen verwendet. Der Ratten-Adenin-Rezeptor konnte in sehr hoher Dichte in Sf9-Insektenzellen exprimiert werden. Die Ko-Expression des Ratten-Adenin-Rezeptors und humaner Gi-Proteinuntereinheiten in Sf9-Insektenzellen ergab eine signifikante Erhöhung der [3H]Adenin-Affinität um etwa den Faktor 3, was sowohl in Sättigungsexperimenten, als auch in homologen Kompetitionsexperimenten gezeigt werden konnte. Es gelang, Antikörper zu designen und zu entwickeln, welche zur Kontrolle der Expression des Ratten-Adenin-Rezeptors in Sf9-Insektenzellen verwendet werden können, und die auch den natürlich vorkommenden Ratten-Adenin-Rezeptor in Rattencortex-Membranpräparationen in Western Blot-Experimenten detektieren. In Mutagenesestudien des Ratten-Adenin-Rezeptors konnte gezeigt werden, dass die postulierten Modelle zur Bindung des Adenins im Rezeptor nicht bestätigt werden konnten. In [35S]GTPγS-Bindungsstudien zeigten die Mutanten N194A und L201A keine Aktivierbarkeit des Rezeptors mehr. Sie scheinen eine wichtige Rolle bei der Konformationsänderung zu spielen, die zur Aktivierung des Rezeptors führt.<br /> Der Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp1 konnte in Sf9-Insektenzellen in ausreichend hoher Dichte exprimiert werden. Durch Radioligand-Bindungsstudien konnte die Vermutung bestätigt werden, dass es sich bei dem mMrgA10-Rezeptor tatsächlich um einen Adenin-Rezeptor handelt. Die Sequenz des Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp1 ist unter der Gen-Bank-Nummer JN662396 zu finden. In cAMP-Akkumulationsexperimenten an stabil mit dem Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp1 transfizierten 1321N1-Astrozytomzellen konnte gezeigt werden, dass der Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp1, wie auch der Ratten-Adenin-Rezeptor und der Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp2, die Adenylatcyclase inhibiert und somit über ein Gi-Protein gekoppelt ist. Zur Charakterisierung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen des Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp1 wurde eine Serie von Adenin-Derivaten getestet. Es ergibt sich folgende Reihenfolge der Affinitäten für den Maus-Adenin-Rezeptor Subtyp1: Adenin > PSB-08162 (3-Methylamino-N-(9H-purin-6-yl)propionamid) > 2-Fluoradenin > PSB-09097 (4-Amino-N-(9H-purin-6-yl)butyramid) > 7-Methyladenin > PSB-09032 (8-Aminoadenin) > 1-Methyladenin > PSB-09073 (3-Amino-N-(9H-purin-6-yl)propionamid).<br /> Da die in vivo-Wirkung von Adenin und Derivaten durch Adenin-Transporter beeinflusst werden kann, wurde untersucht, ob die von uns verwendeten 1321N1-Astrozytomzellen, sowie die häufig für die Rezeptor-Expression eingesetzten HEK293-Zellen, und die als Modelle für neuronale Zellen verwendeten NG108-15-Zellen Adenin-Transporter besitzen. Ein aktiver, Na+-unabhängiger Adenin-Transporter konnte in Wildtyp-1321N1-Astrozytomzellen (sowie solchen, die den Ratten-Adenin-Rezeptor rekombinant exprimieren), nachgewiesen werden. Hingegen scheinen die HEK293-Zellen und NG105-15-Zellen keinen Adenin-Transporter zu exprimieren.<br /> Die vorliegende Arbeit liefert damit wichtige Beiträge zur Charakterisierung der neu entdeckten Familie der G-Protein-gekoppelten Adenin-Rezeptoren sowie erste Informationen über Adenin-Transporter, die vermutlich eine wichtige Rolle bei der Regulation der extrazellulären Adenin-Konzentration spielen. Die Ergebnisse der molekularbiologischen, pharmakologischen und medizinisch chemischen Untersuchungen der Adenin-Rezeptoren können als Grundlage dienen, um weitergehende Einblicke in die Ligand-Bindungstasche und die Rezeptor-Aktivierung der Rezeptoren zu erlangen.