Untersuchungen an neuartigen Polyketidsynthasen aus marinen Schwämmen (Porifera)

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die neuartigen Polyketidsynthasen (PKS) vom SupA-Typ näher untersucht. Diese PKS wurden bisher ausschließlich in marinen Schwämmen, dort jedoch ubiquitär und häufig gefunden. Architekturell den modularen Fettsäuresynthasen (Typ-I-FAS) der Tiere ähnlich, stehen sie jedoch phylogenetisch den bakteriellen Typ-I-PKS deutlich näher. Aufgrund der Domänenstruktur werden als Produkte von SupA mittkettig methylverzweigte Fettsäuren (MBFA) erwartet, die in der Tat in marinen Schwämmen häufig vorkommen. Es wurde der <i>sup</i>-Cluster aus dem Schwamm <i>Theonella swinhoei</i> in <i>Escherichia coli</i> und drei weitere bakterielle Wirte transferiert, jedoch ohne messbare Veränderung der Fettsäureprofile. Die Proteinexpression von SupA in <i>E. coli</i> gelang lediglich in unzureichender Ausbeute, jedoch konnten einzelne enzymatische Funktionen des Multienzyms(SupA_KS1, SupA_AT1, SupA_MT und SupA_ACP) separat überexprimiert werden. Zusammen mit dem ebenfalls in <i>E. coli</i> exprimierten freistehenden Acyl-Carrier-Protein (ACP) SupB und der 4’-Phosphopantetheinyl-Transferase (PPTase) SupC aus dem <i>sup</i>-Cluster ergaben sich erstmals Möglichkeiten funktioneller Studien an einem Vertreter dieses neuartigen PKS-Typs. In Proteinassays mit den zwei ACP des <i>sup</i>-Clusters, der SupA_AT1 und verschiedenen PPTasen konnte gezeigt werden, dass sich beide ACP <i>in vivo</i> durch Koexpression mit der PPTase Svp in die funktionelle Form =<i>holo</i>) umwandeln ließen. <i>In vitro</i> gelang die Umwandlung des ACP SupB weder mit der PPTase Sfp noch mit der PPTase SupC, jedoch konnte das <i>apo</i> -SupA_ACP durch beide genannte PPTasen in seine <i>holo</i>-Form überführt werden, wobei die Funktion der PPTase SupC noch nicht eindeutig bewiesen werden konnte. In den Assays zum Acyltransferase (AT)-ACP-Acyltransfer mit radioaktiv markiertem Acetyl- sowie Malonyl-CoA zeigte sich, dass die SupA_AT1 als Substrat Malonyl-CoA wählt und auf das SupA_ACP überträgt. In umfangreichen Untersuchungen der Fettsäurezusammensetzung sechs mariner Schwämme zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Diversität von MBFA und PKS-Genen für SupA. Zudem enthüllten genetische Daten über das Vorhandensein bakterieller Symbionten des Kandidaten-Phylums „Poribacteria“ aus sechs weiteren Schwämmen, dass die MBFA nur in Schwämmen vorkamen, die solche Bakterien enthielten. Dies waren ausschließlich Schwämme mit hoher Mikroben-Abundanz(HMA-Schwämme). Dagegen enthielten Tiere mit geringer Mikroben-Abundanz (LMA-Schwämme) weder MBFA noch <i>sup</i>-Gene, noch Poribakterien. Damit legen diese Ergebnisse das Vorkommen der <i>sup</i>-Gene in Poribakterien nahe, was durch eine Genom-Analyse eines poribakteriellen Schwammsymbionten bestätigt werden konnte. Mit der vorliegenden Arbeit verdichten sich somit die Hinweise auf eine Produktion der für viele marine Schwämme typischen MBFA durch symbiotische Bakterien des Kandidaten-Phylums „Poribacteria“.