Neurale Linienselektion humaner embryonaler Stammzellen

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation sollte ein effektives Verfahren zur Aufreinigung hESC-abgeleiteter neuronaler Populationen entwickelt werden. Hierfür wurden zwei Strategien eingesetzt. Bei der Promotor-basierten Selektion, wurde die Expression von EGFP unter der Kontrolle des potenziell neuronalspezifischen Talpha1-Promotors verwendet, um die genetisch markierten Zellen zu isolieren. Die Immunoselektion basierte hingegen auf der endogenen Expression des humanen Zelladhäsionsproteins L1 auf der Oberfläche neuronaler Zellen. Die Isolierung und Aufreinigung erfolgte jeweils über eine Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS). <br /> Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS). Hierfür wurden zunächst im ersten Schritt hESC-abgeleitete neurale Stammzellen (hESC-NSCs) gewonnen und bei Erhalt ihrer charakteristischen Marker-Expression stabil und über längere Zeiträume (> 100 Passagen) hinweg kultiviert. Die neurale Differenzierung der hESCs zu hESC-abgeleiteten NSCs erfolgte unter Verwendung eines EB-basierten Differenzierungsprotokolls. Die hESC-NSCs exprimierten eine Reihe von Stammzell-assoziierten Markern, wie Nestin, Sox1, Sox2, und Pax6. Das Expressionsprofil regionalspezifischer Transkriptionsfaktoren wies auf eine anteriore und ventral gelegene Identität der in vitro generierten hESC-NSCs hin. Unter Wachstumsfaktorentzug differenzierten die hESC-NSCs in betaIII-Tubulin- und MAP2ab-positive Neurone, die die Subtyp-spezifischen Differenzierungsmarker für glutamaterge, exzitatorische (VGluT1) bzw. GABAerge, inhibitorische (GABA) Neurone exprimierten. Ausgehend von diesen hESC-NSC-Populationen wurden für die Promotor-basierte Selektion hESC-NSCs transient mit dem Talpha1-EGFP Konstrukt transfiziert. Die ersten EGFP-positiven Zellen konnten 1 Tag nach Wachstumsfaktorentzug-induzierter Differenzierung beobachtet werden. Die Anzahl der EGFP-positiven Zellen nahm entsprechend der Differenzierungsdauer zu. Die maximale Expression von EGFP erfolgte an Tag 4 nach Wachstumsfaktorentzug. Die FACS-Sortierung der vordifferenzierten hESC-NSCs ermöglichte eine effektive Anreicherung der EGFP-positiven Zellen bis zu einer Reinheit von 86%. Nach einer weiteren Differenzierungszeit von 3 bzw. 8 Tagen zeigte sich jedoch, dass die aus hESC-NSC-Populationen angereicherten Talpha1-EGFP-positiven Zellen nur eine geringe Koexpression mit dem neuronalen Marker betaIII-Tubulin aufwiesen und noch überwiegend Nestin-positiv waren. <br /> Die immuno-basierte Aufreinigung von Neuronen erfolgte über die Expression des neuralen Zelladhäsionsmolekül L1. Zwei Tage nach Wachstumsfaktorentzug-induzierter Differenzierung der hESC-NSC konnten die ersten L1-positiven Zellen beobachtet werden. Unter Verwendung der FACS-Technik wurden hochaufgereinigte Populationen von L1-positiven Neuronen mit einer Reinheit von bis zu 96% aus 7 Tage vordifferenzierten hESC-NSC-Kulturen isoliert. Diese Zellen ließen sich erfolgreich kryokonservieren, waren elektrophysiologisch erregbar und bildeten exzitatorische, glutamaterge und inhibitorische, GABAerge Synapsen. Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Kryokonservierungsprotokoll ermöglichte eine durchschnittliche Post-Auftau-Überlebensrate der L1-immunoisolierten Neuronen von 80%. Die Markierung der hESC-NSCs durch Lentivirale Transduktion fluoreszierender Reportergene (EGFP bzw. mRFP) ermöglichte zudem die Untersuchung von Integration und synaptischer Plastizität L1-immunoselektionierter Neurone nach Transplantation.<br /> Insgesamt demonstriert die vorliegende Arbeit, dass es möglich ist, hESC-abgeleitete Neurone über die endogene Expression des Zelladhäsionsmoleküls L1 bei Erhalt ihrer charakteristischen Eigenschaften mittels der FACS-Technik effektiv anzureichern. Ein wesentlicher Vorteil der L1-immuno-basierten Selektion besteht darin, dass hier keine genetische Modifikation der Zellen vorgenommen wurde. Dadurch sind die L1-immunoisolierten Neurone vor allem auch für biomedizinische Anwendungen, wie Transplantationen oder pharmakologische und toxikologische Untersuchungen von besonderem Interesse.