Nebenreaktionen der Ectoin-Synthase aus <em>Halomonas elongata</em> DSM 2581^T und Entwicklung eines salzinduzierten Expressionssystems

Abstract

Als zentrales Thema der Arbeit wurde die Ectoin-Synthase (EctC) aus <i>Halomonas elongata</i> näher charakterisiert. <br /> Das entsprechende Gen <i>ectC</i> wurde im Genom von <i>H. elongata</i> deletiert. Dadurch wurden zwei neue <i>H. elongata</i>-Stämme generiert, <i>H. elongata</i> WUB01 (δ <i>ectC</i>) und WUB02 (δ<i>ectA</i>, δ<i>ectC</i>), und näher charakterisiert. <i>H. elongata</i> WUB01 (δ<i>ectC</i>) wurde als Produktionsstamm für die Ectoin-Vorstufe Nγ-Acetyl-L-2,4-Diaminobuttersäure (ADABA) etabliert. <br /> Zudem wurde das Protein EctC heterolog in <i>E. coli</i> überexprimiert und für <i>in vitro</i>-Experimente sowohl nativ über hydrophobe Interaktionschromatographie als auch C-terminal mit einem His-tag versehen über Ni-NTA-Affinitätschromatographie funktionell isoliert. <br /> Durch verschiedene Methoden wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Aufklärung der Struktur des EctC-Proteins begonnen sowie die Aktivität des Enzyms unter variablen Pufferbedingungen analysiert. <br /> Durch <i>in vitro</i>-Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse zum Substratspektrum des Enzyms gewonnen werden. Neben dem natürlichen Substrat ADABA wurde die Umsetzung von Glutamin zu ADPC (5-Amino-3,4-dihydro-2H-pyrrol-2-carboxylsäure) im Rahmen einer Kondensationsreaktion bestätigt. Erstmalig wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine Reversibilität der EctC-katalysierten Reaktion nachgewiesen, also die enzymatische Hydrolyse zyklischer Strukturen. Als Substrate einer solchen hydrolytischen Aktivität wurden ADPC, DHMICA (4,5-Dihydro-2-methylimidazol-4-carbonsäure) und Homoectoin identifiziert. Das neuentdeckte Produkt ADPC wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit hinsichtlich seiner Biosynthese als auch seiner protektiven Eigenschaften näher charakterisiert und konnte in die Gruppe der kompatiblen Solute aufgenommen werden. Neben Verbesserung des mikrobiellen Wachstums unter osmotischem Stress sowie Schutz von Zellen unter Trockenstress konnte eine proteinstabilisierende Wirkung des ADPC gezeigt werden. Durch Hydroxylierung wurde ein weiteres Derivat dieses neuen Soluts generiert. <br /> Neben den Arbeiten an der Ectoin-Synthase wurde der Promotor des Ectoinbiosynthese-Genclusters aus <i>H. elongata</i> näher untersucht. Die Verwendung einer modifizierten Version dieses Promotorbereichs in einem pBBR1-MCS-Derivat führte zu einem Vektor (pWUB), der erfolgreich für verschiedene homologe und heterologe Proteinüberexpressionen in <i>H. elongata</i> genutzt wurde.