Beteiligung ATP-abhängiger Transportprozesse an der Resistenz gegenüber Platinkomplexen

Abstract

Eine reduzierte zelluläre Kumulation von Cisplatin ist ein häufig beobachteter Mechanismus der Platinresistenz. Es wird vermutet, dass neben der passiven Diffusion auch verschiedene energieabhängige Proteine, welche die Hydrolyse von ATP als Energiequelle nutzen, an dem Transport von Cisplatin, sowohl in die Zelle hinein als auch aus der Zelle heraus, beteiligt sind. Diese Transporter sind bis heute noch nicht vollständig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung von intra- und extrazellulärem ATP an der Cisplatinresistenz in cisplatinsensitiven und -resistenten Ovarialkarzinomzelllinien erstmals systematisch untersucht. Zur Quantifizierung des intrazellulären ATP-Gehalts wurde eine biolumineszenzbasierte Methode optimiert und hinsichtlich Linearität, Präzision, Richtigkeit und Wiederfindung validiert. Es wurde gezeigt, dass der intrazelluläre ATP-Gehalt in den unbehandelten resistenten Zellen signifikant höher im Vergleich zu den parentalen Zellen ist. Dies deutet darauf hin, dass ATP eine Rolle in der Cisplatinresistenz spielt. Bekräftigt wird diese Aussage dadurch, dass in den sensitiven Zellen ein deutlicher Anstieg des intrazellulären ATP-Gehalts innerhalb der ersten Stunden einer Behandlung mit Cisplatin beobachtet wurde. <br /> Im Fokus dieser Arbeit lag insbesondere die Untersuchung der Bedeutung ATP-abhängiger Prozesse für die zelluläre Kumulation von Platinkomplexen. Der intrazelluläre Platingehalt war in den sensitiven Zellen in Anwesenheit des metabolischen Inhibitors Oligomycin signifikant reduziert und in Anwesenheit von extrazellulärem ATP erhöht. Im Gegensatz dazu scheint die zelluläre Aufnahme von Cisplatin in die resistenten Zellen eine untergeordnete Abhängigkeit von intra- und extrazellulärem ATP aufzuweisen. Untersuchungen zum Efflux von Cisplatin unter Einfluss von Oligomycin zeigten in beiden Zelllinien keine Effekte auf den intrazellulären Platingehalt. Demnach können Veränderungen innerhalb des aktiven Effluxtransportsystems nicht als relevanter Resistenzmechanismus in A2780cis-Zellen angesehen werden. Die Na⁺,K⁺-ATPase, ein ATP-abhängiges Transmembranprotein, scheint direkt oder indirekt an der Aufnahme von Cisplatin in die sensitiven Zellen beteiligt zu sein. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit durch Influxversuche in Anwesenheit des spezifischen Na⁺,K⁺-ATPase-Inhibitors Ouabain belegt werden. Eine verringerte Expression der ATPase in der cisplatinresistenten Zelllinie kann zumindest teilweise als Erklärung für die reduzierte Platinkumulation angesehen werden und leistet demnach einen Beitrag zur Cisplatinresistenz der A2780cis-Zellen. Interessanterweise ist der intrazelluläre Platingehalt in A2780-Zellen in Anwesenheit von Oligomycin stärker erniedrigt als unter Einfluss von Ouabain. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass neben dem Na⁺,K⁺-ATPase-vermittelten Transport weitere energieabhängige Prozesse vorhanden sind, die die zelluläre Aufnahme von Cisplatin regulieren. <br /> Sorafenib, ein Inhibitor der ATP-abhängigen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade, führte ebenfalls zu einer Reduktion der zellulären Kumulation von Cisplatin sowie Carboplatin in den sensitiven Ovarialkarzinomzellen. Die in dieser Arbeit aufgezeigte ATP-reduzierende Wirkung von Sorafenib auf die A2780-Zellen liefert einen möglichen Erklärungsansatz für die verminderte Kumulation der beiden Platinverbindungen in diesen Zellen. Allerdings bleiben weitere Mechanismen, insbesondere die Bedeutung der Inhibition des Raf/MEK/ERK-Signalweges für die Platinaufnahme ungewiss und bedürfen eingehenderer Untersuchungen. <br /> Zielgerichtete Therapeutika, wie z.B. Sorafenib, werden in der klinischen Praxis zunehmend in Kombination mit einer platinhaltigen Standard-Chemotherapie eingesetzt, um die Überlebensrate von Tumorpatienten zu steigern. Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten <i>In-vitro</i>-Kombinationsuntersuchung von Sorafenib mit entweder Cisplatin oder Carboplatin konnte eine antagonistische Interaktion in beiden Ovarialkarzinomzelllinien nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um die genauen zellulären Mechanismen der antagonistischen Wirkung aufzuklären und deren klinische Relevanz zu bewerten. Anhand dieser Ergebnisse wird dennoch deutlich, dass eine Kombinationstherapie nicht unbedingt zu einer Erhöhung der klinischen Tumoransprechrate führen muss und mit Vorsicht betrachtet werden sollte. Die Aufklärung der potentiellen und tatsächlichen Kombinationswirkung verschiedener Arzneistoffe auf zellulärer Ebene würde daher einen wichtigen Beitrag zu einem effektiveren Einsatz der antitumoralen Substanzen leisten. <br /> Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis der komplexen zellulären Mechanismen beitragen, die der Platinresistenz zugrunde liegen. Die genaue Kenntnis der einzelnen Resistenzmechanismen ist jedoch allein nicht ausreichend, um die Platinresistenz zu überwinden. Vielmehr ist es von großer Bedeutung einen systembiologischen Forschungsansatz zu verfolgen und die Zelle in ihrer Gesamtheit zu betrachten. Insbesondere die gründliche Erforschung des komplexen Netzwerks von Signalwegen, die für die Platinsensitivität von Bedeutung sind, stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Resistenzüberwindung in der therapeutischen Praxis dar.