Neural crest development in a human embryonic stem cell-based model system

Abstract

The neural crest is a transient embryonic cell population with outstanding characteristics. After their delamination from the closing neural tube, neural crest cells migrate extensively throughout the body and differentiate into highly diverse cell types, including peripheral neurons and glia, but also mesenchymal tissues of the head region. Neural crest development has been extensively studied in several animal models, however, the neural crest of primates, particularly of humans, remains largely inaccessible. The research on human embryonic stem (hES) cells offers a highly interesting possibility to study events of early embryonic development in an in vitro setting. In the thesis presented here, differentiating hES cells were used to study human neural crest development. Remarkably, the process of neural crest delamination is mimicked in the cell culture dish, thereby recapitulating early developmental processes. Cultivation of spontaneously differentiated embryoid bodies (EBs) in neural differentiation medium yielded prominent neural rosettes that, according to their morphology and marker expression, resembled a primitive form of the neural tube. Neural crest cells, identified by expression of the neural crest-associated markers p75NTR, HNK-1, SOXE, and AP2α, migrated from those neural tube-like structures over the fibroncetin-coated dish and formed distinct crescent-shaped aggregates at a defined distance. This process is accompanied by a characteristic cadherin switch, which is typical for an epithelial-to-mesenchymal transition, as it occurs in neural crest development <em>in vivo</em>. The aggregation of neural crest cells into clearly distinguishable clusters could be exploited to purify them from the heterogenous cell culture by manual picking. The level of purity, assessed by expression of p75NTR and SOXE, of the obtained cell population resembled cell populations isolated by Fluorescence Activated Cell Sorting for p75NTR (>95%). Comparison with a neural stem cell population obtained from the same parental hES cell line via microarray analysis confirmed upregulation of neural crest cell markers and distinct differences towards neural stem cells. The purified neural crest cell population could be differentiated into peripheral neurons and glia, as well as to smooth muscle cells, adipocytes, osteoblasts and chondrocytes.<br /> The hES cell-based culture model presented here provides access to early human neural crest development and offers multiple possibilities to study the delamination, migration and differentiation of neural crest cells. Moreover, this model system provides potential for modeling of neural crest-associated diseases and pharmacology testing.

Bei der Neuralleiste handelt es sich um eine transiente, embryonale Zellpopulation mit außergewöhnlichen Eigenschaften. Nach Verlassen des sich schließenden Neuralrohres migrieren die Neuralleistenzellen durch den Körper und differenzieren in verschiedenste Zelltypen. Zu ihren Nachkommen gehören periphere Neurone und Gliazellen, aber auch mesenchymales Gewebe aus der Kopfregion. Die Entwicklung der Neuralleiste wurde in verschiedenen Tiermodellen intensiv erforscht. Auf Grund ihrer Unzugänglichkeit ist über die Neuralleiste in Primaten, speziell im Menschen, jedoch nur wenig bekannt. Die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen bietet eine sehr interessante Möglichkeit die Vorgänge der frühen Embryonalentwicklung <em>in vitro</em> nachzuvollziehen. In dieser Arbeit wurden differenzierende humane embryonale Stammzellen verwendet, um die Entwicklung der Neuralleiste zu untersuchen. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass typische Vorgänge der Neuralleistenentwicklung in der Zellkulturschale abgebildet werden. Durch Kultivierung von spontan differenzierten Embryoid Körperchen in Medium, welches die neurale Differenzierung begünstigt, wurden neurale Rosettenstrukturen gewonnen, die in ihrer Morphologie und Markerexpression einer primitiven Form des Neuralrohres ähneln. Neuralleistenzellen, welche durch die Expression der Neuralleistenmarkern p75NTR, HNK-1, SOXE, and AP2α identifiziert wurden, migrierten von den Neuralrohr-ähnlichen Strukturen über die Fibronektinbeschichtete Schale, um schließlich in einem definierten Abstand halbmondförmige Aggregate zu bilden. Dieser Prozess wurde von einem charakteristischen Cadherin-Switch begleitet, welcher typisch für eine epithelial-mesenchymale Transition ist, die in der Neuralleistenentwicklung in vivo ebenfalls zu beobachten ist. Die Aggregation von Neuralleistenzellen zu klar abgegrenzten Clustern konnte dazu genutzt werden, sie durch manuelle Isolation aus der heterogenen Zellkultur aufzureinigen. Die auf diese Weise angereicherte homogene Zellpopulation exprimierte die Neuralleistenmarker p75NTR und SOXE auf vergleichbar hohem Niveau wie die Zellpopulationen, die durch Fluoresecence Acticated Cell Sorting auf p75NTR aufgereinigt wurden (>95%).<br /> Eine Genexpressionsanalyse zeigte im Vergleich zu einer neuralen Stammzellpopulation, welche aus der selben humanen embryonalen Stammzelllinie gewonnen wurde, eine deutliche Hochregulierung von wichtigen Neuralleisten-assoziierten Genen, sowie klare Unterschiede zu neuralen Stammzellen. Die gewonnene Population von Neuralleistenzellen konnte erfolgreich in periphere Glia und Neurone sowie in die mesenchymalen Zelltypen Chondrozyten, Adipozyten, Osteoblasten und glatte Muskelzellen differenziert werden.<br /> Das hier vorgestellte Zellkulturmodell ermöglicht Zugang zur frühen Entwicklung der humanen Neuralleiste und bietet dadurch zahlreiche Möglichkeiten um ihre Delamination, Migration und Differenzierung zu untersuchen. Dies eröffnet zudem das Potential, Neuralleistenassozierte Krankheiten zu modellieren und pharmakologische Wirkstoffe zu testen.