Molekulare und zelluläre Funktionen des Guaninnukleotidaustauschfaktors Cytohesin-4 im Immunsystem

Abstract

Cytohesine sind eine Familie von Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) für ARF-GTPasen, die in Säugetieren vier Mitglieder umfasst. Sie sind für grundlegende zelluläre Funktionen wie Zelladhäsion und Integrin-Aktivierung, Zellmigration, T-Zell-Rezeptor-Signaltransduktion und den Insulinstoffwechsel von Relevanz. Für Cytohesin-4 sind bislang nur wenige Funktionen bekannt. Da Cytohesin-4 hauptsächlich von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird, wurden im Rahmen dieser Arbeit DC- und T-Zell relevante Cytohesin-4 Funktionen untersucht.<br /> Es konnte nachgewiesen werden, dass Cytohesin-4 in unreifen BM-DC exprimiert wird und im Verlauf der Reifung herunterreguliert wird. Dies konnte auch für T-Zellen nach TCR-Aktivierung gezeigt werden. Sowohl in der Migration unreifer und reifer BM-DC als auch in der Migration und Adhäsion humaner T-Zellen konnte eine funtionelle Rolle von Cytohesin-4 ausgeschlossen werden. <br /> Cytohesine sind an essentiellen T-Zell-Signaltransduktionsprozessen beteiligt. Dabei sind bisher insbesondere die Cytohesine-1 und -3 in aktivierten und toleranten T-Zellen untersucht worden, wohingegen die Rolle von Cytohesin-4 im TCR-Signalweg noch weitgehend ungeklärt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass Cytohesin-4 in den PI3-Kinase/Akt/FoxO Signalweg involviert ist. In der humanen T-Zell-Linie E6 resultierte die Cytohesin-4 Überexpression in einer Reprimierung der Akt-Phosphorylierung. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Cytohesin-4 die Expression des Transkriptionsfaktors FoxO1 positiv steuert und den Zellzyklus-Inhibitor p27 in seiner Expression fördert. Dennoch konnte in diesem Zusammenhang keine Blockierung des Zellzyklus durch Cytohesin-4 dokumentiert werden. <br /> Während Cytohesin-1 Funktionen in humanen Zellsystemen umfassend dokumentiert sind, liegen bislang nur wenige Daten für murine Immunzellen vor. Die kontrollierte Adhäsion von Immunzellen in zentralen immun-regulatorischen Prozessen wie bei der Ausbildung der immunologischen Synapse oder bei der Diapedese wird durch Integrine vermittelt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass Cytohesin-1 Antigen-spezifisch die Zell-Zell-Adhäsion in murinen DC fördert und unter laminaren Flussbedingungen die Zelladhäsion an aktivierte Endothelzellen vermittelt. Darüberhinaus konnte Cytohesin-1 als positiv regulatorisches Protein der Zellmigration in komplexen dreidimensionalen Zusammenhängen charakterisiert werden. Daten dieser Arbeit verifizieren, dass reife murine BM-DC im Gegensatz zu der zweidimensionalen Zellmigration in der dreidimensionalen Zellmigration über einen Integrin-abhängigen und einen Integrin-unabhängigen Migrationsmechanismus verfügen. Dabei konnte gezeigt werden, dass Cytohesin-1 oberhalb von RhoA im Signalweg positioniert ist, und dass die RhoA-Aktivierung die GEF-Funktion von Cytohesin-1 erfordert. Diese Ergebnisse demonstrieren die Bedeutsamkeit von Cytohesin-1 bei Zelladhäsion und Zellmigration reifer muriner DC. Ferner konnte die Beteiligung von RhoA an der Chemokin-induzierten Aktivierung der Integrine in BM-DC und damit verbunden bei der Zelladhäsion an das aktivierte Endothel bestätigt werden. Dies ermöglichte die Entwicklung eines Modells, in welchem Cytohesin-1 in Anwesenheit von Integrinen RhoA aktiviert und so die interstitielle Zellmigration reifer BM-DC fördert. Ergebnisse dieser Arbeit haben somit maßgeblich zu einer Funktionsaufklärung von Cytohesin-1 in der Integrin-abhängigen dreidimensionalen Migration beigetragen. <br /> Bislang sind weder für Cytohesin-1 noch für Cytohesin-4 genetische Mausmodelle verfügbar. In dieser Arbeit wurden erstmals konditionale “Knock-out” Modelle für die Cytohesine-1 und -4 entwickelt. Die jeweiligen Targeting-Strategien wurden entworfen und die Targeting-Vektoren kloniert und in ES-Zellen transferiert. Positive ES-Zell-Klone konnten mittels PCR-und Southern-Blot Strategien identifiziert werden und in Blastozysten injiziert werden. Somit wurden in dieser Arbeit die Grundlagen für die genetischen konditionalen Mausmodelle für Cytohesin-1 und Cytohesin-4 gelegt.