Transcriptome analysis of bovine day 16 conceptus derived after transfer of blastocyst from somatic cell nuclear transfer or in vitro production

Abstract

In vitro embryo production (IVP) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) have been used as tools of assisted reproductive technology to produce bovine pre-implantation embryos independent of the maternal environment. However, the embryonic and fetal losses after transfer of SCNT and IVP derived embryos is higher compared to the in vivo (AI) counterparts. This may be associated with the alterations in the molecular signatures and pathways at any stage of embryonic and /or fetal development. Therefore, to identify the molecular changes that could occur at day 16 SCNT and IVP derived embryos, large scale transcriptomic analysis was performed using Affymetrix-Bovine Genome Array. For this, day 7 blastocysts derived from SCNT, IVP and AI were transferred to oestrus synchronized Simmental heifers. Recipients were then slaughtered at day 16 of gestation and conceptuses were retrieved. Following morphological examination, filamentous embryos with visible embryonic disc were subjected to global tanscriptome analysis. The result demonstrated comparable in vivo development rate in SCNT (72.7%), IVP (62.2%) and AI (77.3%) embryo groups. However, considerable reduction in the trophoblast elongation size was observed in SCNT (93.3mm) compared to IVP (186.6mm) and AI (196.3mm) derived embryos. In addition, more than 20% of SCNT (10.7 mm ± 1.08) and IVP (20.1 mm ± 0.15) conceptuses had tubular shape, suggesting a delay in recapitulating filamentous morphology. Gene expression profiling analysis revealed that the transcript levels of 477 genes, which are involved in various pathways including arginine and proline, glycerolipid and fatty acid metabolism, were significantly altered in SCNT embryos compared to AI. Similarly, 365 genes were differentially expressed in IVP embryos compared to AI. Thus, several canonical pathways including TNRF-1 and tight junction signalling pathways were affected in IVP derived conceptuses. To predict whether the altered transcripts were associated with pre-elongation in vitro culture environment or errors in transcriptional reprogramming, unique or commonly differentially expressed genes were analyzed in SCNT and IVP embryos compared to AI or donor cells (fibroblast). Accordingly, 71 transcripts including (FOLR1, MYO1B, RCN2, H2AFJ, HSPB1 and GATM) were found to be not transcriptionally reprogrammed as their expression resembled more the donor cells than AI embryos. The remaining transcripts were either partially or incompletely reprogrammed. In addition, quantitative real time PCR (qPCR) based expression profiling of candidate transcripts in developmentally delayed SCNT or IVP embryos showed low mRNA levels of IFNt, FGFR2, CLDN1 and ARHGEF2 in developmentally lagging IVP and SCNT embryos compared to their respective elongated counterparts. In conclusion, the present study identified deviation in elongation size, gene expression and the corresponding molecular pathways in day 16 SCNT and IVP conceptuses compared to their AI counterparts which may subsequently be associated with fetal development.

Transkriptom-analyse von bovinen 16 Tage alten Embryonen, gewonnen durch den Transfer von Blastozysten aus klonierten somatischen Zellen sowie der in vitro Produktion<br /> In vitro Embryo Produktion (IVP) und somatischer Kerntransfer (SCNT) sind Werkzeuge der assistierten Reproduktionstechnologien und finden ihren Einsatz um bovine Präimplantations- embryonen unabhängig von der mütterlichen Umwelt zu erzeugen. Allerdings sind embryonale und fetale Verluste nach dem Transfer von SCNT und IVP gewonnenen Embryonen höher im Vergleich zu in vivo (AI) erzeugten Embryonen. Dies kann mit den Veränderungen der molekularen Signaturen sowie Signalwegen in den unterschiedlichen Stadien der embryonalen und/oder fetalen Entwicklung zusammenhängen. Um molekulare Veränderungen zu identifizieren, die am Tag 16 von SCNT und IVP gewonnene Embryonen auftreten können, wurde mit Affymetrix-Bovine Genome Arrays eine Transkriptomanalyse durchgeführt. Hierzu wurden Tag 7 Blastozysten von SCNT, IVP und AI erzeugten Embryonen in Östrus synchronisierte Fleckviehfärsen übertragen. Am Tag 16 der Trächtigkeit wurden die Rezipienten geschlachtet und die Embryonen entnommen. Nach morphologischen Untersuchungen wurden filamentöse Embryonen mit sichtbarer Keimscheibe einer globale Tanskriptomanalyse unterzogen. Das Ergebnis zeigte in den verschiedenen Embryogruppen SCNT (72,7%), IVP (62,2%) und AI (77,3%) eine vergleichbare in vivo Entwicklung. Allerdings konnte eine erhebliche Verringerung in der Größe der Trophoblasten Elongation in SCNT (93,3 mm) im Vergleich zu IVP (186,6 mm) und AI (196,3 mm) Embryonen beobachtet werden. Darüber hinaus wiesen mehr als 20% der SCNT (10,7 mm ± 1,08) und IVP (20,1 mm ± 0,15) Embryonen eine Röhrenform auf, was auf eine verzögerte rekapitulierte filamentöse Morphologie hindeutet. Die Auswertung der Transkriptomanalyse zeigte beim Vergleich von SCNT mit AI 477 signifikant unterschiedlich expremierte Gene, die in verschiedenen Signalwegen beteiligt sind, einschließlich Arginin und Prolin, Glycerolipid und Fettsäure-Metabolismus. Des Weiteren wurden 365 signifikant unterschiedlich exprimierte Gene beim Vergleich von IVP Embryonen mit AI Embryonen identifiziert. Relevante Signalwege dieser Gene waren unter anderem TNRF-1 und Tight-Junction Signalisierung. Um festzustellen, ob die veränderten Transkripte mit der in in vitro Kultur bedingten Präelongation oder mit Fehlern der transkriptionellen Reprogrammierung assoziiert sind, wurden einzigartige oder häufig unterschiedlich exprimierte Gene in SCNT und IVP Embryonen gegenüber AI oder Donorzellen (Fibroblasten) analysiert. Dementsprechend zeigten 71 Transkripte einschließlich FOLR1, MYO1B, RCN2, H2AFJ, HSPB1 und GATM keine transkriptionelle Reprogrammierung, da deren Expressionprofil mehr dem der Donorzellen als dem der AI Embryonen ähnelte. Die restlichen Transkripte waren entweder teilweise oder vollständig reprogrammiert. Zusätzlich, zeigten auf quantitative Real Time PCR (qPCR) basierende Kandidatengenexpressionsprofile in entwicklungsverzögerten SCNT oder IVP Embryonen niedrigere mRNA Spiegel in IFNtau, FGFR2, CLDN1 und ARHGEF2 im Vergleich zu ihren elongierten Gegenstücken. Schlussfolgernd konnten mit dieser Studie Abweichungen in den Elongationsgrößen, den Expressionsprofilen und den entsprechenden molekularen Signalwegen in Tag 16 SCNT und IVP produzierten Embryonen im Vergleich zu AI produzierten Embryonen beobachtet werden. Diese Ergebnisse könnten in Zusammenhang mit den weiteren fötalen Entwicklung gebracht werden.