Der Einfluss von Cyr61 auf die Adhäsionsfunktion von Integrinen und dessen Hemmung durch Heparin als Beitrag für eine antimetastatische Wirkung

Abstract

Die Krebszellmetastasierung ist die häufigste Todesursache der Patienten im Verlauf einer malignen Krebserkrankung. Adhäsionsrezeptoren spielen im Prozess der hämatogenen Metastasierung eine entscheidende Rolle. Neben den bisher intensiv untersuchten Selektinen sind auch Integrine in jeden Teilschritt der metastatischen Kaskade involviert. Durch Förderung der Zellmigration und Vermittlung zellulärer Kontakte im Blutsystem sind sie entscheidend am metastatischen Geschehen beteiligt. Die Aktivität der Integrine wird in diesen dynamischen Interaktionen durch vielfältige Zell-interne aber auch -externe Stimuli beeinflusst. Das Integrin VLA-4 auf Tumorzellen, insbesondere auf Melanomzellen, steht seit einiger Zeit im Fokus des Interesses, da es entscheidend die vaskuläre Adhäsion der Tumorzellen steuert.<br /> Matrizelluläre Proteine wie Cyr61 wirken regulierend auf vielfältige molekulare Vorgänge und fördern die Tumorprogression. Cyr61 interagiert dabei direkt mit den Integrinen und wirkt darüber stimulierend auf Migration und Adhäsion. Heparin ist in der Lage die Wechselwirkung zwischen Integrinen und ihren Liganden zu blockieren und führt somit zu einer reduzierten Zelladhäsion. Dies wird als Beitrag zur antimetastatischen Wirkung von Heparin mit angesehen. Cyr61 besitzt ebenfalls heparinbindende Eigenschaften und wird durch erfolgte Bindung inaktiviert.<br /> Diese Arbeit fokussiert die Cyr61-vermittelte Stimulation der VLA-4/VCAM-1-Wechselwirkung im Adhäsionsgeschehen und ihre potentielle Inhibition durch Heparin.<br /> Die Zellen einer Cyr61 positiven Prostatazelllinie sowie einer hoch metastatischen Melanomzelllinie wurden mit shRNA-Plasmiden zur Herunterregulation des Cyr61 transfiziert. Durch Kombination von durchflusszytometrischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen konnte eine Aussage über den Cyr61 Status und dessen Auswirkung auf die Expression weiterer zellulärer Proteine getroffen werden. Das Integrinmuster wurde ebenfalls analysiert, bevor diese Zelllinien auf den Cyr61-Einfluss in Migrationsversuchen untersucht wurden. Über eine Migrationsabnahme der Cyr61-defizienten Zellen ist ein Zusammenhang des Cyr61 mit migrationsfördernden Integrinen evident. Heparin ist in der Lage die Migration zu beeinflussen. Allerdings konnte in diesen Versuchen nicht unterschieden werden, ob die Heparinwirkung direkt über die Integrine oder über freies Cyr61 erfolgt. <br /> Die Charakterisierung der Cyr61-Wirkung auf das metastasierungsrelevante VLA-4 wurde mit biosensorischen Untersuchungen analysiert. Erstmals konnte eine direkte und hochaffine Bindung des Cyr61 an VLA-4 gezeigt werden. Eine Wechselwirkung des Cyr61 mit dem Proteoglykan Syndekan-4 wurde ebenfalls durch die Bindungsstudien bestätigt. Durch Einsatz einer um ihre Domäne IV gekürzten Cyr61-Mutante konnte gezeigt werden, dass die Bindung an VLA-4 oder Syndekan-4 unabhängig von dieser Domäne ist. <br /> Die literaturbeschriebene Heparinbindefähigkeit des Cyr61 wurde durch Biosensormessungen eindrucksvoll bestätigt. Darüber hinaus konnten auch hier durch den Einsatz strukturmodifizierter Heparine und der Cyr61-Mutante Erkenntnisse zu den Strukturanforderungen des Heparins gewonnen werden. Die Domäne IV kann demnach als Haupt-Heparinbindestelle angesehen werden. Keines der eingesetzten Heparine war jedoch in der Lage, bereits an VLA-4 oder Syndekan-4 gebundenes Cyr61 zu verdrängen. Auf die physiologischen Vorgänge an der Zelloberfläche bezogen, kann für Heparin damit nur sekretiertes und freies Cyr61 als Bindungspartner fungieren. Trotzdem zeigt Heparin einen direkten Einfluss auf die Bindefähigkeit von VLA-4 über Cyr61.<br /> Die Cyr61 defizienten Melanomzellen wurden hinsichtlich ihrer Bindungsfähigkeit an VCAM-1 im Adhäsionsversuch unter Flussbedingungen untersucht. Die Ergebnisse lassen die direkte Beteiligung des Cyr61 an der Bindung des VLA-4 an seinen Liganden VCAM-1 erstmalig deutlich werden. Heparin ist bereits in niedrigen Konzentrationen in der Lage die Cyr61-vermittelte Adhäsion des VLA-4 zu beeinflussen, bevor bei höheren Konzentrationen auch direkt eine Integrinblockade durch Heparin erfolgt. Syndekan-4 konnte als „Korezeptor“ für Integrine, in diesem Fall VLA-4 in bemerkenswerter Weise fungieren. So führt eine geringere Syndekan-4-Expression zu einer signifikant geringeren Adhäsion von VLA-4 an VCAM-1. Die Zugabe von exogenem Cyr61 führt wiederum zu einer Steigerung der VLA-4-vermittelten Adhäsion an VCAM-1. <br /> Die Daten zeigen, dass Cyr61 eine wichtige aber bisher weitestgehend unbeachtete Rolle während der Migration und Adhäsion von Tumorzellen im metastatischen Prozess einnimmt. Das metastasierungssenkende Potential des Heparins kann somit um die von Cyr61 auf die Integrine vermittelten Adhäsionseffekte erweitert werden. Dabei wird eine völlig neue Heparin/Cyr61/VLA-4 Achse betrachtet, die nur in geringen Heparinkonzentrationen zum Tragen kommt und bisher durch höhere Heparinmengen faktisch überdeckt wurde. Das komplexe Zusammenspiel von Cyr61 und Integrinen mit Heparin sollte als neuer Ansatzpunkt in die Diskussionen um die antimetastatische Wirksamkeit von Heparin aufgenommen werden.