Investigations into interferon response of novel bat cell cultures upon alphavirus infection

Abstract

Bats have been identified as reservoir for human pathogenic zoonotic viruses like Rabies, Marburg or Henipaviruses. The fact that bats carry viruses without showing clinical symptoms, raised the question if these flying mammals have evolved specific mechanisms to suppress virus replication. To address this question a bat cell culture model was established to investigate the IFN response upon virus infection.<br /> First, cell lines of E. helvum, Epo. buettikoferi and R. aegyptiacus were generated, immortalised and characterized. IFN sensitivity upon viral and artificial IFN-stimuli was analysed by pan-bat IFN real-time RT-PCR assay. To enable comparative analysis of species-specificity and inter-species bioactive IFN secretion the VSV-bioassay was optimized. It was adapted to each cell line and the pan-species IFN enabled with the EC50 factor the determination of relative secreted bioactive IFN concentration. <br /> To determine IFN-signalling, the mRNA expression levels of several IFN stimulated genes (ISGs) were determined with established species-specific real-time RT-PCR assays. These methods enabled comparable studies between bat, murine and human cell lines. The role of bats within the life cycle of arthropod borne alphaviruses is not clear. The prevalence of cross-reactive antibodies was determined by an Immunofluoresence assay, analysing bat sera from several continents and species. In average 5% of the serological samples were found positive which is a comparably low seroprevalence. Interestingly, some Old World bat samples showed exclusive reactivity with New World alphaviruses and vice versa. This cross-reactivity might indicate that the phylogenetic range of alphaviruses in bats could be much higher. In an alphavirus infection model with O´nyong-nyong virus (ONNV) high IFN-induction on mRNA level was detected in all cell lines. Conversely, IFN secretion was reduced. Although IFN-signalling seemed to be more sensitive on mRNA expression level in bat cell lines, this could not be confirmed on protein levels. These results indicated a translational rather than a transcriptional shutoff upon alphavirus infection in bat cell lines. To investigate if these results were ONNV-specific, two additional alphaviruses, Sindbis and Chikungunya virus (SINV and CHIKV), were tested. These infection experiments showed similar results suggesting a general mechanism of alphaviruses to antagonize the IFN response. Interestingly, bat cell lines showed similar IFN response as human cell lines. Generated bat cell lines, designed pan-bat or species-specific real-time RT-PCR assays and the optimized VSV-bioassay altogether enable a detailed analysis of the IFN response to virus infections in bat cell lines, which was especially on the bioactive IFN protein level in this comparable way not possible before.

<strong>Untersuchungen der Interferonantwort in neuen Fledertierzellkulturen nach Alphavirusinfektionen</strong><br /> Fledermäuse wurden als Wirte von zoonotischen, humanpathogenen Viren, wie Tollwut, Marburg- oder Henipaviren, identifiziert. Als Träger von pathogenen Viren zeigen die Fledermäuse keine klinischen Symptome einer Erkrankung. Daher wurde spekuliert, ob sie im Laufe der Evolution spezielle Mechanismen zur Unterdrückung der Virusreplikation entwickelt haben. Zur Verifizierung dieser Frage, wurde die IFN-Antwort, bestehend aus IFN-Induktion, -Sezernierung und -Signalwirkung, auf Virusinfektionen in Fledermauszellen im Vergleich zu murinen und humanen Zellkulturmodellen untersucht. <br /> Zunächst wurden Zellkulturen von E. helvum, Epo. buettikoferi und R. aegyptiacus generiert, immortalisiert und charakterisiert. Mit Hilfe eines pan-spezies IFN Real-Time RT-PCR Assays konnte gezeigt werden, dass die generierten Fledermauszelllinien in der Lage sind, sowohl auf virale als auch auf artifizielle IFN-Stimuli zu reagieren. Die Optimierung des VSV-Bioassays ermöglicht die Detektion von sezerniertem IFN unter Berücksichtigung der Spezienspezifität und Interspezifität. Dazu wurde das Assay individuell an jede Zelllinie angepasst und mit Hilfe des EC50-Faktors die Vergleichbarkeit der Konzentration des sezernierten IFNs ermöglicht. <br /> Zur Bestimmung der IFN-Signalwirkung wurden verschiedene ISG mRNA- Expressionen mittels Spezies-spezifischen Real-Time RT-PCR Assays bestimmt. Durch die Entwicklung der entsprechenden Assays war es möglich, vergleichende Experimente durchzuführen. Ob Fledermäuse ebenfalls als Wirte für Alphaviren in Frage kommen, wurde bisher nur vermutet. Mit Hilfe einer serologischen Studie wurde daher die Prävalenz von kreuzreagierenden Antikörpern gegen Alphaviren in Fledermäusen verschiedenster Kontinente bestimmt. Es wurde eine Prävalenz von durchschnittlich 5% festgestellt. Dies ist eine vergleichsweise niedrige Seroprävalenz. Einige Altweltfledermausproben waren interessanterweise nur für Neuweltalphaviren positiv und umgekehrt. Dies lässt vermuten, dass die phylogenetische Spanne innerhalb der Alphaviren in Fledermäusen größer ist, als bis jetzt angenommen. <br /> In einem Alphavirusinfektionsmodell konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit ONNV in allen Zellen eine hohe IFN-Induktion zur Folge hatte. Kontrovers hierzu konnte eine Reduktion der IFN-Sezernierung gemessen werden. Obwohl die IFN-Signalwirkung bei Fledermäusen auf mRNA-Ebene sensibler zu sein schien, konnte dies auf Proteinebene nicht bestätigt werden. Daher kann auch bei Fledermäusen auf einen Translationsabbruch nach Alphavirusinfektion geschlossen werden. Zur Klärung, ob die Ergebnisse ONNV-spezifisch waren, wurden die gleichen Versuche noch mit zwei weiteren Alphaviren (SINV und CHIKV) durchgeführt. Die Ergebnisse hieraus bestätigen, dass Fledermauszellen eine der humanen ähnliche IFN-Antwort besitzen und die beobachteten Mechanismen wahrscheinlich allgemeingültig für Alphaviren sind. <br /> Künftig kann also die IFN-Antwort auf Virusinfektionen zwischen Fledermaus- und humanen Zelllinien vergleichend auf allen Ebenen untersucht werden. Die generierten Zelllinien, die entwickelten Spezies-spezifischen Real-Time RT-PCR Assays und das optimierte VSV-Bioassay ermöglichen im Zusammenspiel detaillierte Erkenntnisse über die IFN-Antwort der Fledermauszellen auf Virusinfektionen, die im Besonderen auf der bioaktiven Proteinebene noch nahezu unerforscht ist.