Fluoreszenzmarker der hochauflösenden Einzelmolekülmikroskopie

Abstract

In eukaryontischen Zellen findet der Stoffaustausch zwischen Zellkern und Cytoplasma über die in die Zellkernmembran eingebetteten Kernporenkomplexe statt. Makromoleküle können die Pore nur passieren, wenn sie einen transportvermittelnden, löslichen Transportrezeptor binden können. Es ist bisher nicht bekannt wie die <i>Selektivität</i> des Transports auf molekularer Ebene realisiert wird. Eine Möglichkeit diese zu untersuchen, ist die Abbildung <i> einzelner </i> Transportvorgänge mittels EMFM. Dieses Vorhaben stellt hohe Ansprüche an die apparative Technik und die Konzeption des Experiments, da eine hohe zeitliche Auflösung und eine präzise Lokalisierung erforderlich sind. <br /> Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine Technik etabliert, um zu transportierende Proteine mit fluoreszierenden Nanopartikeln, sogenannte Quantum Dots (QD), zu visualisieren. Diese zeichnen sich durch eine hohe Photostabilität und Helligkeit aus und ermöglichen damit selbst bei hohen Aufnahmeraten eine Nanometer-Lokalisierung. Zur Funktionalisierung der QD wurde hier eine Kopplungstechnik verwendet, bei der Transportrezeptor und QD-Kern <i> direkt </i> miteinander verknüpft werden. Die Transportfähigkeit dieser Sonde wurde mit dem Importrezeptor Importin β1</nobr> überprüft. Konfokal konnte eine spezifische Interaktion der Sonde mit der Kernmembran beobachtet werden, ein erfolgreicher Import ließ sich jedoch selbst mittels sensitiver EMFM nicht nachweisen. Hierfür wurden maßgeblich die Größe der Sonde und eine mögliche Funktionsbeeinträchtigung des Importin β1</nobr> verantwortlich gemacht. Da sich die vorgestellte Kopplungstechnik jedoch insgesamt als geeignet zur Präparation einer Transportsonde erwies, konnten vielversprechende Ansätze für die zukünftige Präparation einer transportfähigen Sonde abgeleitet werden. <br /> Trotz ihrer herausragenden Eigenschaften eignen sich Quantum Dots nicht für alle Anwendungen in der Fluoreszenzmikroskopie. Daher finden in der EMFM weiterhin hauptsächlich organische Farbstoffe Anwendung – oft unter anspruchsvollen Bedingungen: Die präzise Lokalisierung verlangt eine hohe Anregungsintensität, die wiederum jedoch verstärkt zu Photobleichen führt. Für den Anwender sind zur Planung und Interpretation von Experimenten zwei bislang in der Literatur nur unzureichend quantifizierte Kenngrößen der Fluorophore wichtig: Zum einen die <i> Bleichzeit </i> τ – Ausdruck dafür, wie lange sich der einzelne Farbstoff im Mittel anregen lässt bevor er bleicht; zum anderen die <i> Zahl der emittierten Photonen N </i> – in Bezug auf t ein Maß der Helligkeit und direkt mit der Lokalisierungsgenauigkeit verknüpft. <br /> Diese Arbeit beschäftigte sich im zweiten Teil mit der Ermittlung von τ und <i>N</i> für die Fluoreszenzfarbstoffe Cy5, AF647, AF546, Atto647, Atto647N und Atto655. Zunächst wurde dazu eine Technik zur stabilen und spezifischen Immobilisierung der Farbstoffmoleküle an der Deckglasoberfläche etabliert, die eine Analyse in wässriger Lösung erlaubte. Weiterhin wurde eine größtenteils automatisierte Auswertung entwickelt. Für die Farbstoffe konnten so Werte für τ und <i>N</i> in zwei bekannten Puffersystemen <i>in vitro </i></nobr> ermittelt werden. Zudem wurde die <i>in vivo</i>-</nobr>Tauglichkeit der Analyse am Beispiel von Atto655 demonstriert. Damit wurde eine Technik zur Farbstoffanalyse entwickelt, die sich unmittelbar auf beliebige Farbstoff/Puffer-Kombinationen anwenden lässt.