Untersuchungen zur Polyoloxidation in <em>Gluconobacter oxydans </em>und<em> Thermotoga maritima</em>

Abstract

Die Biotechnologie nutzt für industrielle Produktionsverfahren Organismen, Enzyme oder Enzymsysteme. Einige Enzyme des mesophilen Essigsäurebakteriums Gluconobacter oxydans und des thermophilen Eubakteriums Thermotoga maritima, die für ihre große Anzahl an Zucker- und Polyol-Transportern und Oxidoreduktasen bekannt sind, werden bereits innerhalb industrieller Prozesse biotechnologisch eingesetzt. Es besteht deshalb fortwährend ein großer Bedarf an neuen oder optimierten Enzymen und somit auch an molekularen Werkzeugen zur Charakterisierung dieser viel versprechenden Proteine, sowie für die Optimierung von Stämmen zur heterologen und homologen Genexpression. Mit dieser Zielsetzung wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Überexpressionssystem für G. oxydans erfolgreich etabliert. Unter der Verwendung von konstitutiven Promotoren aus G. oxydans ist es gelungen die Gene der cytoplasmatischen D-Arabitol-Dehydrogenase aus G. oxydans (gox2181) und T. maritima (tm0297) in die konstruierten Vektoren pBBR1p264 und pBBR1-p452 zu klonieren und in G. oxydans zu exprimieren. Die Aminosäuresequenzen der D-Arabitol-Dehydrogenase aus T. maritima und G. oxydans weisen eine hohe Homologie zueinander auf. Die außergewöhnliche Stabilität und Aktivität der Enzyme aus T. maritima, unter Einfluss hoher Temperaturen, machen diese für den Einsatz in biotechnologischen Prozessen besonders interessant. Während der Charakterisierung dieses Enzyms konnte gezeigt werden, dass bei der Oxidation von D Arabitol der seltene und teure Zucker D-Ribulose entsteht. <br /> Im Zuge dieser Arbeit wurde zudem, unter der Verwendung von speziellen G. oxydans Deletionsmutanten, das Substratspektrum der membrangebundenen Sorbitol-(SLDH) und Alkohol-Dehydrogenase (ADH) näher untersucht. Die Feststellung, dass die Membranfraktion der Deltasld-Mutante noch in der Lage war D-Arabitol zu dem seltenen Zucker D-Lyxose zu oxidieren, nicht aber Mannitol oder Sorbitol, zeigte, dass D-Arabitol ein spezifisches Substrat der Alkohol-Dehydrogenase ist. Zudem ließ eine erhöhte Oxidationsrate von Fruktose in der Membranfraktion der Deltasld-Mutante darauf schließen, dass in der Membran ein weiteres Enzym für die Oxidation von Fruktose verantwortlich sein muss.