Chemical modulation of guanine nucleotide exchange factor activity

Abstract

The small GTPase Rab5 is a key regulator in the early endocytic pathway. The activity of Rab5 is controlled by numerous guanine nucleotide exchange factors (GEFs), which catalyse the exchange of GDP for GTP. However, the precise role of specific GEFs, e.g. Rabex-5, for the regulation of certain Rab5 functions remains to be solved. Small molecule inhibitors that target Rab5GEFs could be used to unravel the complex regulation of Rab5. For none of the RabGEFs a specific small molecule inhibitor is available, despite their interesting biological role. Hence, it is questionable whether these proteins represent a class of druggable targets.<br /> In this thesis, the identification and characterization of the first small molecule inhibitor of Rabex-5 is reported. The inhibitor was identified in a screening approach that monitored the Rabex-5-catalysed nucleotide exchange on Rab5 in a fluorescence-based assay. Screening of a library containing 13,000 compounds yielded the small molecule JH5 among several other primary hits. The activity of the most promising hits was confirmed in an independent radioactive nucleotide exchange assay. The in vitro characterization of JH5 revealed that this compound inhibits the Rab5 activation by binding to Rabex-5 with a Kd of 2.6 µM. This affinity is among the strongest compared to the already reported ArfGEF and RhoGEF inhibitors with activities in the mid-micromolar range. Although various GEF domains show structural similarities, it was possible to identify a small molecule that can selectively inhibit the Rabex-5 nucleotide exchange. The nucleotide exchange of the RhoGEF Vav-1, the RabGEF DrrA and the Arf1GEF Cytohesin-2 was not disturbed by JH5. Among these, Cytohesin-2 and DrrA represent the most stringent controls because they act by a catalytic mechanism which is similar to that of Rabex-5. <br /> Investigation of the structure activity relationship of JH5 revealed the importance of the thiol group at position 3 of the central 1,2,4-triazole core. Since addition of the reducing agent dithiothreitol abolished the activity of JH5, a covalent binding mechanism was suspected. Mass spectrometry analysis and Rabex-5 cysteine-to-serine-mutants revealed that JH5 might indeed interact with one of the C terminal positioned cysteines of the Rabex-5 GEF domain. Although the proof for the intracellular applicability of JH5 is pending, its identification and characterization supports the hypothesis that RabGEFs are suitable targets for the development of specific small molecule inhibitors. Due to the combination of high affinity with excellent specificity over other GEFs, JH5 is a promising lead compound for the investigation of Rabex-5 and Rab5 biology. Moreover, JH5 provides a starting point for lead optimization or virtual screening approaches, which are likely to yield even more potent compounds. These can assist in unravelling the complex role of Rabex-5 and Rab5 in health and disease.

<strong>Chemische Modulierung der Aktivität eines Guaninnukleotid Austauschfaktors – ein Inhibitor für die Rabex-5 vermittelte Rab5 Aktivierung</strong><br /> Die GTPase Rab5 reguliert zentrale Funktionen des frühen endosomalen Transportweges. Die Aktivität von Rab5 wird durch vielzählige GTP-Austauschfaktoren, die den Austausch von GDP zu GTP katalysieren, kontrolliert. Allerdings ist die genaue Rolle einzelner GTP-Austauschfaktoren, wie Rabex-5, an der Steuerung der verschiedenen Rab5 Effekte bislang ungeklärt. Kleine organische Moleküle, die als Inhibitoren der Rab-GTP-Austauschfaktoren fungieren, könnten eingesetzt werden, um die komplexen Funktionen von Rab5 aufzuklären. Jedoch sind bislang keine Substanzen bekannt, die Rab-GTP-Austauschfaktoren spezifisch hemmen. Daher ist unklar, ob diese Proteinklasse überhaupt mit niedermolekularen Inhibitoren moduliert werden kann. <br /> Diese Arbeit stellt die Identifizierung und Charakterisierung des ersten Inhibitors für Rabex-5 vor. Eine Bibliothek mit 13000 Substanzen wurde in einem Screening getestet. In dem Screening wurde der Rabex-5 katalysierten Nukleotid Austausch an Rab5 in einem fluoreszenzbasierten Assay detektiert. Dabei wurde die Substanz JH5 sowie weitere Primärhits identifiziert. Die Aktivität der vielversprechendsten Hits wurde in einem unabhängigen radioaktiven Nukleotid-Austausch-Assay verifiziert. In der anschließenden in vitro Charakterisierung von JH5 konnte gezeigt werden, dass JH5 mit einer Kd von 2.6 µM an Rabex 5 bindet und dadurch die Aktivierung von Rab5 inhibiert. Im Vergleich zu den bekannten niedermolekularen Inhibitoren anderer GTP-Austauschfaktoren, welche Affinitäten im mittelern mikromolaren Bereich besitzen, ist JH5 einer der affinsten Inhibitoren. Obwohl die katalytischen Domänen der verschiedenen GTP-Austauschfaktoren strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen, ist es gelungen, einen Inhibitor zu identifizieren, der den Rabex 5 vermittelten Nukleotid-Austausch selektiv unterbindet. Der Rho-GTP-Austauschfaktor Vav-1, der Rab-GTP-Austauschfaktor DrrA und der Arf-GTP-Austauschfaktor Cytohesin-2 werden nicht von JH5 inhibiert. Unter diesen Proteinen stellen Cytohesin-2 und DrrA die stringenteren Kontrollen dar, da ihr katalytischer Mechanismus dem von Rabex-5 ähnelt.<br /> Untersuchungen der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von JH5 legten nahe, dass die Thiol-Gruppe an Position 3 des zentralen 1,2,4-Triazol-Zentrums von entscheidender Bedeutung ist. Da die Zugabe des Reduktionsmittels Dithiothreitol JH5 inaktiviert, wurde ein kovalenter Wirkmechanismus vermutet. Massen-Spektrometrie-Analysen und Rabex 5 Cystein-zu-Serin-Mutanten deuteten auf eine Interaktion von JH5 mit einem der C terminal positionierten Cystein-Reste in der katalytischen Domäne von Rabex-5 hin. Obwohl die zelluläre Anwendbarkeit von JH5 noch nicht bewiesen ist, zeigt die Entdeckung dieses Moleküls, dass Rab-GTP-Austauschfaktoren geeignete Zielstrukturen für die Entwicklung von kleinen organischen Molekülen als Inhibitoren sind. Die hohe Affinität von JH5 bei exzellenter Spezifität gegenüber anderen GTP-Austauschfaktoren machen JH5 zu einem vielversprechenden Werkzeug für die Analyse der biologischen Funktionen von Rabex-5 und Rab5. Des Weiteren stellt JH5 eine Leitstruktur für Optimierungen sowie einen Ausgangspunkt für virtuelle Screenings dar, aus denen noch potentere Substanzen hervorgehen sollten. Diese werden der Aufklärung der komplexen Funktionen von Rabex-5 und Rab5 in (patho-)physiologischen Systemen dienen.