Substratreduktionstherapie der Metachromatischen Leukodystrophie

Abstract

Metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine lysosomale Speichererkrankung, die durch die Defizienz des lysosomalen Enzyms Arylsulfatase A (ASA) verursacht wird. Normalerweise katalysiert die ASA den Abbau von 3-O-Sulfogalaktosylceramid (Sulfatid) zu Galaktosylceramid. Das Fehlen von ASA-Aktivität führt zu einer intralysosomalen Speicherung des Lipids Sulfatid, woraus eine fortschreitende Demyelinisierung im zentralen und peripheren Nervensystem resultiert. Da bis heute keine effektive Therapie existiert, steht die Schmerz- und Symptombehandlung im Vordergrund. Substratreduktionstherapie (SRT) ist ein vielversprechender Ansatz, da dieser auf der Gabe von kleinen chemischen Molekülen basiert, welche die Blut-Hirn-Schranke überqueren können. Der letzte Schritt in der Synthese von Sulfatid, wird durch das Enzym Cerebrosid-Sulfotransferase (CST) katalysiert, wobei eine Sulfatgruppe von 3´ Phosphoadenosin 5´-phosphosulfat (PAPS) auf Galaktosylceramid übertragen wird. Dieses Enzym stellt daher einen interessanten Angriffspunkt für eine mögliche SRT dar. Große Mengen an CST werden benötigt, um eine detaillierte Strukturanalyse und die Testung spezifischer Inhibitoren durchzuführen und somit diesen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von MLD zu ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine stabil transfizierte CHO-Zelllinie generiert, die die Expression löslicher und aktiver humaner CST in großen Mengen erlaubt. Die Zellen sekretieren ein Fusionsprotein, bestehend aus der luminalen Domäne humaner CST, dem Signalpeptid von Transin zur Sekretion und der IgG-Bindedomäne von Protein A zur Reinigung. Erstmals war es möglich, größere Mengen des rekombinanten Enzyms aus Zellkulturüberständen in aktiver Form zu reinigen. Zusätzlich konnte für die Hochdurchsatz-Testung potentieller Inhibitoren eine nicht-radioaktive Methode zur Aktivitätsbestimmung der im Rahmen der vorliegenden Arbeit produzierten und gereinigten löslichen CST entwickelt werden. Die Methode beruht auf einer gekoppelten Enzymreaktion mit einer zweiten Sulfotransferase (SULT1A1), die das während der CST-Reaktion gebildete Adenosin-3´,5´-bisphosphat zu PAPS regeneriert, wobei das Substrat 4-Methylumbelliferylsulfat zu 4 Methylumbelliferon umgesetzt wird. Dies führt zu einer Änderung des Fluoreszenzsignals und lässt somit den Aktivitätsnachweis zu. Die im Rahmen dieser Arbeit für die CST entwickelte fluorimetrische Bestimmung macht erstmals den nicht-radioaktiven Aktivitätsnachweis im Hochdurchsatz möglich. Inwieweit mit der entwickelten Methode potentielle Inhibitoren für die CST zu finden sind, wird sich in näherer Zukunft durch die Testung großer Substanzbibliotheken zeigen.