Einfluss kompatibler Solute auf die Thermostabilität prokaryotischer Ribosomen und die Aktivität der zellfreien Protein-Synthese

Abstract

Kompatible Solute sind kleine, organische und gut wasserlösliche Moleküle, die von vielen Organismen unter osmotischem Stress cytoplasmatisch akkumuliert werden, um die verschiedenen Wasseraktivitäten zwischen ihrem Cytoplasma und dem sie umgebenden Medium auszugleichen. Da sie nicht negativ auf den Zellmetabolismus wirken werden sie kompatibel genannt. Gleichzeitig ist jedoch, neben ihrer osmotischen Wirkung, auch der stabilisierende Effekt auf Proteine unter Salz- oder Temperaturstress gut belegt. Bei der Wirkung kompatibler Solute auf Nukleinsäuren deuten erste Erkenntnisse auf eine Destabilisierung von dsDNA und RNA-Sekundärstrukturen hin, während RNA-Tertiärstrukturen teilweise stabilisiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher der Effekt kompatibler Solute auf prokaryotische Ribosomen, als natürliche RNA-Protein-Komplexe, im Hinblick auf die thermische Stabilität untersucht. In mehreren Publikationen wird die Bedeutung der Ribosomen für das Überleben der Zellen diskutiert, da ihre Integrität, aufgrund der zentralen Stellung als Proteinfabriken der Zellen, vermutlich die obere Temperaturgrenze des Überlebens der Zellen bestimmt. Durch kalorimetrische Messungen konnten unterschiedliche Einflüsse der analysierten Solute Saccharose, Trehalose, Betain, Ectoin und Hydroxyectoin auf die Thermostabilität der Ribosomen <i>in vitro</i> und <i>in vivo</i> nachgewiesen werden. Dabei wurde auch gezeigt, dass die Ribosomen der beiden in dieser Arbeit verwendeten Modellorganismen, <i>Escherichia coli</i> und <i>Halomonas elongata</i> in kalorimetrischen Messungen reproduzierbar in drei voneinander unabhängigen Reaktionen denaturieren. Der erste Peak konnte der Denaturierung der 30S-Untereinheit zugeordnet werden, während die beiden anderen Peaks vermutlich von der Denaturierung der 50S-Untereinheit stammen. Dabei kommt entweder eine getrennte Denaturierung der ribosomalen Proteine und der rRNA oder eine zweistufige Aufschmelzung des Protein-rRNA-Komplexes in Betracht. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Effekt der kompatiblen Solute auf die Aktivität der Ribosomen. Dazu wurde eine zellfreie Protein-Synthese mit Luciferase als Reporterprotein genutzt und die Solute in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt. Während die Zucker in hohen Konzentrationen (>250 mM) die Aktivität senken, wurde mit den Ectoinen eine Steigerung beobachtet.