Synthese und Charakterisierung neuer fluoreszenzmarkierter Adenosinrezeptor-Liganden als pharmakologische Sonden

Abstract

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren stellen für einen Großteil der zugelassenen Arzneistoffe die Zielstruktur dar und haben somit eine herausragende therapeutische Relevanz. Um detailliertere Informationen über die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor zu erhalten und damit die Suche nach neuartigen Arzneimitteln zu erleichtern, werden neben potenten und selektiven Substanzen auch potente fluoreszenzmarkierte Liganden benötigt, die beispielsweise in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden können. Diese fluoreszenzmarkierten Liganden sollten neben hoher Affinität insbesondere auch Photostabilität aufweisen, um bei einem längeren Beobachtungszeitraum nicht auszubleichen. Die Klasse der BODIPY-Derivate erfüllt diesen Anspruch. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher funktionalisierte BODIPY-Derivate entwickelt, die im Vergleich zu den kommerziell erhältlichen BODIPY-Derivaten deutlich kleiner und leicht derivatisierbar sind und damit bioisoster in den Pharmakophor eingebaut werden können. Neben den bereits zu einem früheren Zeitpunkt entwickelten Bromalkyl- und Aminoalkyl-Derivaten, wurden BODIPY-Derivate, die über eine Iod-, Carboxyl-, Methoxyester-, terminale Alken-, Thioester- oder Thiol-Funktion verfügen, dargestellt. Desweiteren konnten BODIPY-Derivate mit α,Α-Dibromfunktionalisierung, Methoxy- und Dihydroxy-Funktionalität erhalten werden. In einigen Fällen ist es möglich, dass die Einführung der BODIPY-Fluorophore, durch ihre hohe Lipophilie zu einer geringen Löslichkeit der Liganden in den gängigen Pufferlösungen der Testsysteme führt. Daher wurden BODIPY-Derivate entwickelt, die durch die Einführung von Sulfonsäuregruppen wasserlöslich sind. Alle dargestellten Fluorophore wiesen exzellente spektroskopische Eigenschaften auf. Exemplarisch wurden für ein BODIPY-Derivat (Verbindung 3) Stabilitätsuntersuchungen durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass die synthetisierten Verbindungen unter basischen, reduktiven und oxidativen Bedingungen sehr stabil sind. Lediglich unter sauren Bedingungen erfolgte eine teilweise Zersetzung des Fluorophors. Ein entstandenes Nebenprodukt konnte anhand von LC-MS Spektren postuliert werden.<br /> Mit Hilfe der neu dargestellten BODIPY-Derivate wurden fluoreszenzmarkierte Adenosinrezeptorliganden dargestellt. Es gelang fünf fluoreszierende Adenosinrezeptorliganden (Verbindungen 56 - 60) in guten Ausbeuten zu erhalten. Die so dargestellten fluoreszierenden Liganden wurden daraufhin pharmakologisch in Radioligand-Bindungsstudien und in funktionellen Studien hinsichtlich ihrer Affinitäten, Aktivitäten und Selektivitäten untersucht. Die fluoreszierenden Adenosinrezeptorliganden zeigten Affinität zum A₁-, A_2A- und A₃-Rezeptor im mittleren nanomolaren bis hin zum unteren mikromolaren Bereich. Erwartungsgemäß konnte keine Bindung an A_2B-Rezeptoren beobachtet werden. Die affinste Verbindung am A₁-Rezeptor war Verbindung 57 mit einer mittleren Alkylkettenlänge. Am A_2A-Rezeptor zeigte Verbindung 59 die größte Affinität. Am A₃-Rezeptor konnte Verbindung 58 als affinste Substanz identifiziert werden. Mit einem Ki-Wert von 211 nM war 58 damit auch die affinste Verbindung dieser Serie. In cAMP-Akkumulationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass alle fluoreszenz-markierten Verbindungen am humanen A_2A-Rezeptor Vollagonisten sind. Die Testsubstanzen 57-60 wirkten am humanen A₃-Rezeptor ebenfalls als Vollagonisten. Die Verbindungen 56 zeigte hingegen partiell agonistisches Verhalten. Die hier synthetisierten und in radioaktiven Bindungs- und funktionellen Studien pharmakologisch untersuchten Derivate stellen somit wichtige Werkzeuge für die Entwicklung fluoreszenzbasierter Assays oder für Fragestellungen, die mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden können, dar.<br /> Obwohl in den letzten Jahren eine Vielzahl von Adenosin-Rezeptor-Liganden entwickelt wurden, sind derzeit sehr wenige selektive Adenosin-Rezeptor-Liganden auf dem Markt. Ein Grund für den langsamen Fortschritt bei der Entwicklung von Arzneistoffen, die selektiv Adenosin-Rezeptoren adressieren, sind möglicherweise die ungünstigen pharmakokinetischen Eigenschaften und die geringe Wasserlöslichkeit sowie die damit einhergehende schlechte Bioverfügbarkeit vieler sehr lipophiler Verbindungen. Daher wurde in einem weiteren Projekt auf der Suche nach neuen, potenten und selektiven Liganden eine Serie von Adenosin-Derivaten pharmakologisch untersucht, die Modifikationen in Position 2 und/oder 5’ aufwiesen. Eine Unterserie orientierte sich dabei an der zur Zeit sich in klinischen Studien befindlichen Verbindung Binodenoson, welche als Diagnostikum bei koronaren Herzerkrankungen Einsatz finden soll. Das Hauptpotential von potenten und selektiven A_2A-Adenosinrezeptor Agonisten liegt begründet in ihren antiinflammatorischen und immunsuppresiven Eigenschaften. Weitere mögliche Anwendungsgebiete potenter A_2A-Agonisten liegen in der Behandlung von Psychosen und von Chorea Huntington. Die Anwendung ist allerdings wegen hypotensiver Effekte bedingt durch die Aktivierung von A_2A-Rezeptoren im Herzen und der Blutgefäße eingeschränkt. Daher wurde in unserem Arbeitskreis mit Verbindung 75 (PSB-0777) eine hochpolare, nicht-absorbierbare Substanz entwickelt, die lokale, antiinflammatorische Eigenschaften besitzt und beispielsweise bei der Behandlung von chronisch entzündlichen Darmkrankheiten wie Morbus Crohn, Colitis ulcerosa oder dem Reizdarmsyndrom unter Vermeidung systemischer Effekte Einsatz finden könnte. Weiterführende ex-vivo-Studien mit dieser Verbindung zeigten in entzündeten Ratten Ileum/Jejunumpräparaten diesbezüglich vielversprechende Ergebnisse. <br /> Es konnten außerdem mehrere Derivate mit hoher Affinität und Selektivität zu Adenosin-Rezeptor-Subtypen identifiziert werden. Einige Verbindungen dieser Serie zeigten in cAMP-Akkumulationsexperimenten agonistisches Verhalten, sodass neue Leitstrukturen für die Entwicklung selektiver A_2A- und A₃-Agonisten gefunden wurden. <br /> Im Rahmen dieser Arbeit wurden desweiteren antagonistische Derivate, die auf den Grundstrukturen der 1<em>H</em>-Purin-6,8-dion und 8<em>H</em>-Purin-8-on beruhen, in-vitro-pharmakologisch in Radioligand-Rezeptor-Bindungsstudien hinsichtlich ihrer Affinität zu Adenosinrezeptoren untersucht. Es konnten mehrere Verbindungen mit Ki-Werten im mittleren bis unteren nanomolaren Bereich sowohl am A₁- und A_2A- als auch am A_2B-Rezeptor identifiziert werden. Für den A₃-Radioligandrezeptor wurden mehrere hochpotente Substanzen gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Verbindung 168 ein hochpotenter und gegenüber den anderen Subtypen selektiver Antagonist am humanen A₃-Rezeptor identifiziert, der aufgrund der exzellenten Affinität und Selektivität als pharmakologisches Tool bei Untersuchungen an nativen Geweben genutzt werden kann. Obwohl in den letzten Jahren einige potente und selektive A₃-Antagonisten entwickelt wurden, befindet sich derzeit keine dieser Substanzen in der klinischen Entwicklung. Mit der Identifizierung von Verbindung 168 als hochaffiner Antagonist am A₃-Rezeptor ist im Rahmen dieser Arbeit ein vielversprechender Kandidat gefunden worden, der in weiterführenden Studien hinsichtlich der Eignung für klinische Studien untersucht werden muss.